干细胞向甲状旁腺细胞的分化及在甲状旁腺功能减退中的研究进展

李佳丽 赵瑞力

作者单位：050011 石家庄，河北医科大学第四医院科研中心；050011石家庄，河北医科大学第四医院耳鼻咽喉头颈外科

干细胞是一类能够自我复制、自我更新，具有多向分化潜能，能产生多种分化细胞类型的细胞，主要包括骨髓干细胞、脂肪干细胞、胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESCs）和诱导多潜能干细胞（iPS）等[1-2]。目前骨髓干细胞已经被广泛的应用于血液系统疾病的临床移植治疗中。ESCs和iPS是多能干细胞，能够分化成除胎盘外的所有组织，已经被广泛的应用于疾病机制、药物毒性和细胞移植治疗研究中[3-4]。骨髓干细胞、脂肪干细胞和ESCs均为异体来源细胞，移植后存在免疫排异的风险。iPS可以来自人体的任何组织，利用自体iPS来源的组织细胞进行移植，避免了移植后免疫排斥的问题，近年来引起医学科研人员的高度重视[3]。

甲状旁腺功能减退是由于甲状旁腺素（PTH）分泌不足导致的以低钙血症和高磷血症为特征的内分泌疾病。由于甲状旁腺位置比较隐蔽，手术过程中很难做到对其进行识别和保护，导致术后一过性或持续性甲状旁腺功能减退患者越来越多。对于甲状旁腺功能减退的治疗方案主要包括补充高剂量的维生素D和钙剂、PTH替代治疗和甲状旁腺自体或异体移植，这些方案都不能从根本上治疗该疾病[5-8]。鉴于干细胞技术的进步及在医学科研中取得的成绩，尤其是干细胞技术在糖尿病机制研究和细胞移植治疗研究中的进展[9]，考虑内分泌系统的另一类疾病甲状旁腺功能减退可能同样适用干细胞进行治疗。甲状旁腺发挥作用的机制是，通过细胞表面钙离子受体（CaSR）监测血浆中Ca2+浓度，进而调节细胞内合成的PTH向周围环境的释放，因此甲状旁腺细胞仅需进入体内循环系统就能发挥作用，而不需重建甲状旁腺的组织结构，基于此特点，甲状旁腺功能减退患者更适合应用细胞移植治疗。

人类有两对甲状旁腺，上面的一对起源于第四咽囊的内胚层，下面的一对起源于由第三咽囊内胚层和神经嵴细胞形成的甲状旁腺胸腺原基[10]。在甲状旁腺的发育过程中，首先是祖细胞形成，祖细胞穿过原条形成定性内胚层，定性内胚层形成以后的甲状旁腺和胸腺，此阶段的细胞表达内胚层的特异性标记物Hoxa3、 Pax1、Eya1和Pax9。第二阶段是甲状旁腺胸腺原基形成，此阶段的细胞表达Six1和Pbx1。第三阶段是甲状旁腺和胸腺的成型，Sonic hedgehog（Shh）是一个分泌型糖蛋白，在此阶段发挥重要作用[11]。接下来甲状旁腺和胸腺分离，甲状旁腺细胞表达特异性因子GCM2、CaSR和PTH，胸腺细胞表达特异性因子Foxn1。

WNT和TGFβ信号通路能够阻止原条和定性内胚层的形成[12-13]。Nodal是TGFβ亚家族成员，高水平Nodal能够促进定性内胚层形成[14]，高活性的Nodal蛋白不容易获得。Activin能够结合和Nodal相同的受体[15]，因此被用来体外模拟Nodal活性，高浓度的Activin 和低浓度的血清能够促进原条和定性内胚层的分化[16-17]。

建立在甲状旁腺发育的分子基础上，干细胞向甲状旁腺细胞的分化需在两个阶段进行干预，即干细胞向定性内胚层的分化和定性内胚层向甲状旁腺细胞的分化。目前干细胞向甲状旁腺细胞的分化被详细报道的有：ESCs、胸腺上皮细胞和扁桃体间充质细胞。

一、ESCs

美国密歇根大学Doherty教授团队分别采用两株ESCs株BG01和H1进行向甲状旁腺细胞的分化[18-19]。首先采用D'Amour分化法[20]进行分化，即将BG 01/H1细胞株接种在铺有小鼠胚胎成纤维细胞的培养板中，在RPMI1640培养基中加入100 ng/ml Activin A和递增浓度的小牛血清（FBS），分化的第一个24 h FBS浓度为0﹪，第二个24 h FBS浓度为0.2﹪，接下来以2.0﹪的FBS浓度维持培养3 d，此阶段为诱导ESCs向定性内胚层的分化。接下来进行定性内胚层向甲状旁腺细胞的分化[18]，收集分化5 d的细胞，重新接种于未铺过小鼠胚胎成纤维细胞的组织培养板中，使用含 100 ng/ml Activin A、5﹪ 的 FBS和 100 ng/ml Shh的RPMI1640培养基培养7 d。结果显示分化5 d的细胞表达定性内胚层标志物FoxA2和Sox17，轻度表达甲状旁腺分化的标志物Eya1、BMP4和noggin，不表达成熟甲状旁腺的特异性标志物CaSR、CCL21、GCM2和PTH；分化12 d的细胞除表达定性内胚层标志物外，还表达胸腺甲状旁腺原基特异性标记物Hoxa3、Pax1和Six1，和甲状旁腺细胞特异性标记物。进一步研究发现，在分化的第一阶段，加入成型因子Shh能够使分化5 d的细胞轻度表达甲状旁腺特异性标志物GCM2，第二分化阶段中Shh的加入能够使分化中的细胞更早更多的表达甲状旁腺特异性标记物CaSR和PTH。说明100 ng/ml Activin A和递增浓度的FBS能够完成ESCs向定性内胚层的分化，Shh的加入能够促使ESCs向甲状旁腺细胞的分化。

二、胸腺上皮细胞

考虑到胸腺和甲状旁腺具有相同的组织学来源，同样由美国密歇根大学Doherty教授团队采用儿童胸腺上皮细胞转分化成甲状旁腺细胞[21]。采用手术切除的儿童胸腺组织，按Mouiseddine[22]方法分离胸腺上皮细胞和胸腺间充质细胞，鉴定发现胸腺上皮细胞对内胚层和甲状旁腺标记物的表达高于胸腺间充质细胞，因此选用胸腺上皮细胞进行向甲状旁腺细胞的转分化。和ESCs向甲状旁腺细胞分化略有不同的是，胸腺上皮细胞向甲状旁腺细胞的转分化只需在第二阶段进行干预，即利用Shh因子的成型作用实现胸腺上皮细胞向甲状旁腺细胞的转变。采用Bingham方法[18]，即将胸腺上皮细胞培养在含5﹪ FBS、100 ng/ml Activin A和100 ng/ml Shh的RPMI1640培基中，培养6 d后的细胞高表达甲状旁腺特异性标志物，但此时细胞尚未贴壁，培养上清中未检测到PTH，分化4周的细胞部分贴壁，分泌高水平PTH，分泌8周的细胞完全贴壁，大量分泌PTH，并且甲状旁腺细胞分泌PTH的水平能被培养上清中高浓度的钙离子所抑制。将转分化后的甲状旁腺细胞通过皮下注射方式移植进RAG2基因敲除的小鼠内，3个月后小鼠体内未见瘤体形成。说明采用100 ng/ml Activin A和100 ng/ml Shh能够实现胸腺上皮细胞向甲状旁腺细胞的转分化，并且分化后的细胞在小鼠体内不具有成瘤性。

三、扁桃体间充质细胞

收集临床上因扁桃体增生而行扁桃体切除术的儿童患者的扁桃体组织，分离收集扁桃体间充质细胞[23]，同样采用Bingham方法进行扁桃体间充质细胞向甲状旁腺细胞的转分化[18]，即用含 5﹪ FBS、100 ng/ml Activin A和100 ng/ml Shh的RPMI1640培基进行培养，分化7天后的细胞和培养上清均表达PTH，甲状旁腺细胞分泌PTH的水平受培养血清中钙离子浓度的影响，高浓度钙离子抑制细胞内PTH的分泌，低浓度钙离子促进PTH的分泌，甲状旁腺细胞的培养上清能够促使前成骨细胞株MC3T3-E1的骨形成，将在基质胶内呈三维状态生长的甲状旁腺细胞移植进雄性SD大鼠制成的甲状旁腺功能减退模型内，大鼠的生存率和血清PTH分泌水平明显升高[23-24]。基质胶移植到大鼠体内，可能存在组织相容性的缺陷。同一科研团队又进一步采用明胶和丙烯酸羟丙酯制成明胶制品[25]，将分化后的甲状旁腺细胞移植进该明胶制品内，发现甲状旁腺细胞能够持续大量分泌PTH，将该明胶制品包被的甲状旁腺细胞移植进甲状旁腺功能减退模型大鼠内，大鼠的生存率和体内血钙水平均提高[26]。另有其他科研团队报道，将分化后的甲状旁腺细胞包装在聚二甲硅氧烷成分的凹面微孔板内[27-28]，发现细胞成活率变高，并且表达高水平的PTH、甲状旁腺分泌蛋白1和细胞粘附分子N-钙黏连蛋白，将包装在聚二甲硅氧烷凹面微孔板内的甲状旁腺细胞移植进SD大鼠制成的甲状旁腺功能减退模型大鼠腹腔内，50﹪大鼠存活超过3个月，大鼠体内PTH和钙离子水平均在生理范围内[29]。说明100 ng/ml Activin A和100 ng/ml Shh同样能够实现扁桃体间充质细胞向甲状旁腺细胞的转分化，并且分化后的甲状旁腺细胞能够在甲状旁腺功能减退模型大鼠内起到一定的治疗作用。

北京清华长庚医院罗斌教授团队曾经发表在Medical Hypotheses上一篇综述，提出脂肪干细胞具有分化成甲状旁腺细胞的潜能，应用脂肪干细胞来源的甲状旁腺细胞治疗甲状旁腺功能减退具有一定的应用前景[30]，但未见详细数据报道。哈尔滨医科大学周毅教授团队曾经发表在Chin Med J上的一篇文章报道称[31]，将转入人类PTH基因的血液干细胞通过尾静脉注射进雌性小鼠制成的甲状旁腺功能减退模型内，模型小鼠症状缓解，血清钙离子和PTH浓度3个月内保持在正常水平。可能是由于转入PTH基因的血液干细胞携带病毒载体，并且转入PTH基因后的血液干细胞表面不含有钙离子受体，不能自主调节血浆中钙离子浓度，此方法未见进一步的研究和应用。

综上所述，采用D'Amour和Bingham法将ESCs、胸腺上皮细胞和扁桃体间充质细胞分化后的甲状旁腺细胞，能够表达成熟甲状旁腺细胞特异性标记物和提高甲状旁腺功能减退模型大鼠的生存率、血清PTH和钙离子水平，因此采用干细胞来源甲状旁腺细胞移植治疗甲状旁腺功能减退具有一定的可行性和临床价值。ESCs存在一定的伦理问题，胸腺上皮细胞和扁桃体间充质细胞均为成体细胞，存在细胞数量有限、培养困难和移植后免疫排斥的问题。iPS细胞是一种体细胞重编程的、具有无限增殖和多向分化能力的、形态和功能都类似ESCs的细胞。iPS技术用于细胞移植的优势在于，自体iPS细胞来源的组织细胞进行移植，避免了免疫排斥问题。目前iPS技术已经被广泛的应用于糖尿病、心肌梗塞和视网膜黄斑变性细胞代替治疗研究中，并且取得了可观的成绩。鉴于iPS技术的优势及在医学研究中取得的成绩，考虑应用患者体细胞重编程来源的iPS细胞分化成的甲状旁腺细胞去治疗甲状旁腺功能减退具有更广阔的前景和临床应用价值。这是今后的研究方向，相信随着医学科研水平和国民经济实力的提高，iPS细胞来源的甲状旁腺细胞移植治疗甲状旁腺功能减退指日可待。