数字PCR技术在临床中的应用

蒋惠莉

（青海省西宁市第一人民医院检验科 青海 西宁 810000）

基因扩增技术是分子生物学领域中非常重要的实验方法。近年来发展迅速，从最初采用凝胶电泳法对扩增产物进行定性或半定量分析[1]，到目前广泛使用的根据荧光探针信号实时观察和已知标准品来推算未知样本拷贝量的实时荧光定量PCR法(qPCR)[2]，现在已发展到可以对核酸的拷贝数进行绝对定量的数字PCR(Digital PCR，dPCR)。数字PCR不依赖于扩增曲线的循环阈值（CT）和标准曲线等参数，与常规定量PCR技术相比，具有更高的重复性、灵敏性及准确性[3-5]。本文主要从dPCR方法的原理，优势及其在医学应用方面进行了阐述。

1.数字PCR基本原理

1999年，美国学者Kenneth Kinzler与Bert Vogelstein首次提出了“数字 PCR”的概念[6]。dPCR的基本原理大致分为三个步骤，第一步将PCR反应体系分配到大量微小的反应单元中，使每个微反应单元中不包含或包含一个或多个拷贝的目标分子，其目的是为了实行单分子模板扩增。第二步，进行扩增反应，扩增结束后检测每个反应单元荧光信号的有无。第三步，最终根据泊松分布原理，通过统计分析阳性反应单元的个数与比例，计算出目的核酸序列的拷贝数[7]。根据对反应体系的分配方式不同，数字PCR主要分为微流体芯片式数字PCR(cdPCR )和微滴式数字PCR(ddPCR )两大类[7]。

2.数字PCR的优势

2.1 绝对定量

dPCR采用终点荧光检测和阳性反应单元比例进行定量分析，与qPCR相比较不需要标准品，也不需制作标准曲线，实现真正意义上的绝对定量[1]。

2.2 抑制剂耐受性强

dPCR在反应体系分配的过程中，不仅使目的序列分配到每个反应单元，同时其反应抑制物也被被均匀分配到每个反应单元，从而降低了抑制剂对反应的干扰。所以，dPCR较适合检测复杂样品中核酸的绝对定量。

2.3 高灵敏度和高精准度

dPCR是将PCR反应分割在数万个独立单元中进行降低了抑制物影响，从而提高了检测的灵敏度，可以精确地检测出变化很小的目的序列。并且分割的独立反应单元数目越多，其灵敏度与准确度也越高[2]。

3.数字PCR在临床中的应用

3.1 癌症早期发现与诊断

随着对癌症的不断认识，大量研究表明癌症是由于癌基因及抑癌基因的突变、插入或缺失等的一种基因（染色体）异常变化引起的疾病[8]。筛查患者外周血中游离的循环肿瘤DNA（cell-free circulating tumor DNA，ctDNA），对发现早期肿瘤，及肿瘤的发展及复发进行观测有着重要的意义[9]。不过，循环肿瘤DNA含量低，通常与大量正常细胞同时存在，对检测手段的灵敏度及抗干扰有着更高的要求。数字PCR的检测灵敏度可达到0.0001%～0.001%[10]，特别适合在复杂样本中检测稀有突变。Kinugasa H等学者利用dPCR技术对75例胰腺癌患者血清K-ras基因突变进行分析，并将其结果与生存率进行比较，ctDNA分析可作为检测胰腺癌患者基因突变的一种非侵入性检测方法，也可作为诊断胰腺癌和预测生存的新策略[11]。

3.2 产前诊断

产前诊断是优生和预防缺陷儿的出生的非常重要的手段,通过羊水及母血清筛检胎儿遗传物质是否有异常是目前产前筛查较长用的方法，尤其是无创产前诊断能够更早、更快、更安全的进行产前诊断。然而,胎儿游离DNA在母体血浆DNA占10%～20%[12]，极低含量的胎儿游离 DNA混杂于大量母体DNA中[7]，选择合适的方法学尤为重要。dPCR可从高背景母体DNA中识别少量胎儿DNA分子，在介入性产前诊断及无创产前基因诊断胎儿非整倍体疾病、单基因病等方面都具有重要作用[13]，而且能够检测到存在的嵌合体或污染母体DNA的信号[14]。Tsui NB等利用dPCR技术研究胎儿血友病突变基因，在12例样本中准确识别出7个具有突变基因的胎儿[15]。

3.3 病原微生物分子诊断

目前，对病原微生物核酸的检测，应用于临床多为实时荧光定量PCR，定量检测需要依赖标准曲线的建立，不同厂家及不同批次的标准品均有可能影响定量结果。数字PCR结果分析不需要标准曲线，结果重复性较好，并且其高灵敏的特点更加适用于对低拷贝的目的基因检测。Sedlak RH等进行了人类巨细胞病毒对造血细胞或器官移植患者的发病和死亡的研究，发现dPCR技术能够更早的检测到患者外周血中的巨细胞病毒，从而能尽早治疗，减低移植失败率[16]。

3.4 器官移植

患者接受器官移植后自身免疫系统可能把移植器官当做异物，引起排异反应。传统监测指标多数为检测患者血液中各类蛋白、酶类、代谢物等浓度水平，其不能及时的评估早期器官移植的损伤[17]。由于器官移植也是基因组移植，对移植器官的游离DNA(graft-derived circulating cell-free DNA，GcfDNA)进行监测，可早期发现移植物损伤，从而早期干预，改善移植患者的预后[17][18]。数字PCR可以快速地量化GcfDNA的百分比和绝对数量，这个过程不需要供体DNA，因此可以应用于任何器官捐赠者/受体对[17]。Schutz E等学者，使用液滴数字PCR(ddPCR)技术对115名肝移植患者血浆GcfDNA进行监测，研究结果表明GcfDNA的诊断敏感性和特异性分别为90.3%和92.9%，与传统的常规肝功能检查相比，在肝移植患者中对急性排斥反应更为敏感[19]。Beck等研究者使用dPCR检测GcfDNA，检测出稳定肝移植患者体内GcfDNA的含量小于6.8%，稳定肾移植患者小于2.5%,心移植小于3.4%[7][20]。

4.结语

数字PCR的出现为分子生物学、微生物学等领域提供了新的实验方法，其应用也越来越广泛。但是，目前数字PCR由于每块芯片的数万个反应单元都是对单一样本分析，通量较低，故实验成本高[2]。另外，dPCR对较高浓度样本检测时，当数万个检测单元达到饱和，其绝对定量结果就不十分精准。随着对实验方法的不断研究，dPCR技术会进一步发展与完善，将有着更加广阔的应用前景。

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