特殊生物显微标本的火棉胶包埋制片法

郑 翔，苏 璐，马玉琼，毕文杰，李小京

当代生物医学显微制片工作中,石蜡和冷冻制片法占主导地位,一般分别用于永久切片制作和快速诊断[1]。火棉胶包埋制片法作为最早的制片手段,正在逐渐淡出教学和科研领域。我们认为,该法不受青睐的原因主要有以下3点：1)包埋、切片操作至少历时约3周,而石蜡、冷冻法最快分别为2 d和1 h,故火棉胶法耗时最长；2)切片操作须使用滑行切片机,连续切片或批量制片难度较大[2]；3)火棉胶易被某些染色剂着染,需要控制背景染色。以本文作者所在的3所院校为例,除作者外,在职人员现已无人掌握本技术。近年发表的论文中也鲜见使用该法[3-5],且报道的技术流程仍显陈旧。根据实践,火棉胶法虽然耗时长,对经验要求较高,但在处理过硬或过软的标本、特大尺寸标本(短径超过3 cm)、特厚(超过50μm)切片等特殊场合,仍然无法被取代。本文将以脑特殊染色及甲状腺常规制片为例,介绍火棉胶包埋制片法的原理、操作过程和技术经验,争取使该方法在显微制片应用领域发挥应有的作用。

1 技术原理

火棉胶包埋制片法的主要步骤与石蜡包埋制片法[1]类似。标本经化学固定、脱水,然后被火棉胶包埋剂浸透,硬化后行显微切片[2]。火棉胶(collodion)是 “硝化纤维素”(nitrocellulose,旧称“硝化棉”或 “火棉”)的凝胶样形态,其溶液呈黏稠液体。火棉胶与水不相溶,包埋前也需严格脱水。火棉胶法与石蜡法也有显著区别：1)火棉胶包埋硬化通过溶剂挥发实现,(石蜡法则为冷凝),标本不变形但耗时很长；2)火棉胶块的硬度与挥发前溶液的浓度正相关 (石蜡块的硬度则与石蜡熔点正相关[1])；3)火棉胶块的韧性和硬度大于石蜡块,一般采用滑行切片机制片,失败率很低；4)火棉胶切片须保存于70～90乙醇,且大多用漂片法染色,操作相对麻烦,但处理大尺寸切片更为灵活。

2 梯度火棉胶溶液的制备

我们近年来提高了标本脱水效率[7]。新的脱水方法可移植用于火棉胶包埋标本,火棉胶的溶剂换用四氢呋喃。絮状硝化纤维素或充分干燥、回收的火棉胶块可直接用四氢呋喃溶解、稀释。四氢呋喃本身的挥发性很强,浸透和包埋操作的步骤与经典方法相同。四氢呋喃流程配液更简便,耗时约短,且标本收缩、硬化程度更低。

3 标本预处理的要求

火棉胶包埋制片对标本的要求较低。厚度(最窄处的尺寸)在5 cm以下、硬度不太大 (如钙化组织局部脱钙不彻底),均可顺利切片。固定液的要求也与石蜡法大致相同,但含高浓度苦味酸的固定液 (特别是Bouin配方[1])处理后,须用70乙醇充分洗脱,避免其妨碍火棉胶的凝固硬化。

表1 标本脱水和火棉胶浸透流程(标本厚度2 cm)

4 脱水、包埋流程

用于火棉胶包埋的标本,固定后可按表1所示的流程行脱水与火棉胶浸透。表1依据2 cm厚标本制定,尺寸过大时应大幅增加各步的用时。火棉胶制片法的标本,过度硬化一般不降低切片成功率。在浸入胶液后,各步时长分别增加1～2天,未见不利影响(70乙醇以后、浸入胶液前的各步,延时过长标本将显著收缩)。

图1 火棉胶包埋块及其底座

5 滑行切片操作

6 染色操作

火棉胶切片的染色流程也包括染色前处理、染色、脱水、封片4个环节[1]。其中,染色前从70乙醇起梯度下行入水,不需去除胶片。染色一般用漂片法。染色容器常用培养皿或多孔培养板。以脑切片Nissl染色为例,操作流程如表2所示,之后将切片转移至载玻片上,常规中性树胶封片。封片时不能单用二甲苯,以免胶片收缩。我们通常采用叔丁醇完成最后的脱水,而封片树胶用四氢呋喃溶解。大部分特殊染色 (如本文髓鞘染色[8])都可在本流程的基础上稍加调整即可完成。

表2 猫脑火棉胶切片Nissl染色操作流程(片厚20μm)

表2 (续表)

常规HE染色参考表3的流程。HE染色时注意稍延长染色后水洗和乙醇脱水的时间,以褪去火棉胶片的红色背景。

镀银染色标本在包埋前已完成染色[6],可按表4的流程操作。封片时只滴树胶,不加盖玻片。

表3 火棉胶切片HE染色流程 (片厚10μm)

表4 镀银染色标本的火棉胶切片处理流程 (片厚80μm)

7 制片结果和优势

火棉胶包埋制片法制作的染色切片,除常采用特制大尺寸玻片外,外观上与石蜡法的成品无显著差别。显微镜下观察,特大尺寸标本、硬度差别较大的标本及厚切片等,结构完整性、美观性和立体层次感显著优于石蜡切片标本。此处以脑和甲状腺为例 (均采用Olympus C5060WZ数码相机,显微镜为Olympus BX41,照相转接筒为订制)。

1)火棉胶法用于制作人和猫等脑标本的断面图谱 (如图3所示),断面尺寸大而平整,常规石蜡制片法无法完成此项操作。

2)石蜡切片上甲状腺滤泡有胶质裂痕,火棉胶法无此人工假象 (如图4所示)。

3)石蜡法致脑镀银染色标本部分结构褪色、神经突起过早切断,且难以制作超过30μm的优质切片。火棉胶切片上神经突起的结构清晰自然,染色均匀浓重,可制作厚片,镜下立体层次感强(如图5所示)。

图3 脑染色结果

图4 狗的甲状腺HE染色比较

图5 猫脑海马CA2区冠状面切片Golgi镀银染色比较

8 讨论

本文介绍的火棉胶包埋制片法,既继承了经典技术方法,又融入了我们的经验和改进。其中,一些技术细节应予重视。如配8火棉胶液时,勿在尚未充分溶解前加入乙醚,否则更难溶解。以前常用12的胶液包埋,但实践表明,8的浓度已足够,且节省两步约6天。市售5火棉胶作包埋剂时,切片在乙醇中保存更易产生褶皱,不宜久置。包埋模具的内表面须光滑、易与胶块分离。老书中均记载自制折叠纸盒的方法。但对大尺寸标本,纸盒不实用。一次性饮水纸杯是很好的选择,不变形、不渗漏,包埋后杯壁与胶块也完全不粘连。包埋期间挥发不可过快,否则胶块内部未凝固,经70乙醇硬化定型后,内外质地不一,切片质量低。修块回收的胶应先在干燥箱中完全干燥,再重新配置成8溶液。银染标本的胶块因易变黑而不再回收。火棉胶切片脱水、透明的最后步骤不能采用无水乙醇和二甲苯。无水乙醇要溶解胶片,造成结构离散,而二甲苯会使胶片严重收缩。我们在95乙醇之后,过渡到叔丁醇中完成彻底脱水,切片不溶解、不收缩。相应地,把树胶的溶剂换成四氢呋喃(叔丁醇挥发干燥过慢),封片效果良好。

滑行切片机是火棉胶制片的关键设备。由于设备构造和操作的原因,滑行切片的速度比轮转式切片慢,且要获取厚度精确的连续切片难度较大。但是,滑行切片对标本的软硬程度和尺寸的要求很宽松,即使标本脱水不良也极少遭遇切片失败。因此,滑行切片机在特殊标本的火棉胶切片、石蜡切片和冷冻切片[9]场合都有用武之地。滑行切片机的构造几十年来改变极小,当前市售新机型可安装一次性刀片,不需磨刀。

火棉胶切片极少用于组织化学实验。主要原因是连续制片难,切片厚度较大,大分子标记物渗透慢。有报道用轮转式切片机切火棉胶块[10],可解决切连片和薄片的问题 (此法无处理大尺寸标本和厚切片的优势)。此外,火棉胶受热易变形,检测项目受限。但火棉胶包埋介质及其操作本身并不影响这些检测反应,曾有用火棉胶切片做分子检测[11]的报道。

9 结束语

火棉胶包埋制片技术历史久远,至今仍不能被完全取代。如需处理尺寸特别大、硬度很高或很低的标本,或者要求切片既要厚度尺寸大,又要结构精细[12],应考虑使用本方法。本法还在脑定位图谱绘制、标本三维重建、胚胎整装片制作和神经束路追踪等工作中发挥重要作用。在更好的技术手段发展成熟之前,我们不应忽视和忘记火棉胶包埋制片法。

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