雷帕霉素抑制光老化成纤维细胞周期阻滞的研究

秦登科，贾传龙，卢勇舟，杨清建，陈亮，吴心愿，任润健，朱晶晶，郭妤，杨平，周轶群，毕波，朱宁文，刘天一

1.复旦大学附属华东医院整形外科，上海200040；2.复旦大学附属华山医院皮肤科，上海200040

皮肤的衰老除了受内源性因素影响外，也受外源性因素影响，包括吸烟、饮酒和光照等[1-2]。中波紫外线（ultravioletB,UVB）照射是导致皮肤光老化的重要原因，表现为皮肤皱纹增多、色素沉着及失去弹性等[3]。此外，UVB照射还会导致皮肤成纤维细胞（fibroblasts,FBs）正常周期改变，p53和p21等周期相关蛋白分泌增加，破坏细胞正常的复制分裂过程，使细胞停滞在S期，影响细胞正常的结构和功能，加剧细胞老化和凋亡[4-5]。近期许多研究发现，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）通路的抑制剂雷帕霉素（rapamycin,RAPA），作为一种新型大环内酯类免疫抑制剂，具有调节衰老的重要作用[6]。虽然已有关于RAPA对细胞增殖、周期和信号通路的相关报道，但RAPA在光老化周期阻滞方面的研究甚少。本研究旨在探索RAPA是否能够改善UVB照射导致的小鼠FBs周期阻滞。

1 材料与方法

1.1 小鼠真皮FBs获取 取1～3 d SPF级C57BL/6小鼠，乙醚处死后浸泡于75%酒精中约10min，用培养基（dulbecco'smodifiedeaglemedium,DMEM）洗去残留酒精，放入培养皿内，剪刀分离后背皮肤，剪下面积约为1cm×1cm的皮肤组织，立即置于2%中性蛋白酶内，4℃冰箱过夜。第2天取出皮肤，镊子分离表皮真皮，剪碎真皮后置于0.1%胶原酶中，37℃下消化1.5h，至皮肤的组织基本消失。1500r/min离心5min，收集沉淀，弃上清，细胞以 DMEM+10%胎牛血清（fetalbovineserum,FBS）重悬，反复吹打直至均匀，以2×105/cm2的细胞密度接种在培养皿内，于37℃、5%CO2、100%饱和湿度的培养箱内培养，将近80%～90%融合传代，比例约为1∶4。

1.2 药物预处理及光老化模型建立 选用P1代细胞，用含有不同浓度RAPA的DMEM+10%FBS处理48h。CCK-8试剂盒检测细胞活性，选取最适浓度。实验共分4组：Ctrl组(非RAPA处理，非UVB照射)、RAPA组 (RAPA处理，非 UVB照射)、UVB照射组 (非RAPA处理，UVB照射)、UVB+RAPA组 (RAPA处理，UVB照射)。利用UVB照射建立FBs的光老化模型(stress-induced premature senescence,SIPS)[4]，吸除培养液，加入少量磷酸盐缓冲液 (phosphate bufferedsaline,PBS)覆盖细胞，移走培养皿盖，放置在UVB灯 (PhilipsTL20w/01RSlamp)正下方，首次照射剂量(使用Lutron UV light meter测量)为120mJ/cm2，距离细胞7.5cm，照射后吸除PBS，加入10mL DMEM+1%FBS继续培养，照射间隔时间为12h，每次照射时间为120s，共4次，末次照射后改为DMEM+10%FBS 培养[4]。

1.3 -半乳糖苷酶染色 吸除6孔板中的细胞培养基，用PBS洗涤2次后每孔加入0.25 mL的4%多聚甲醛固定液，室温下固定15 min。吸除细胞固定液，用PBS洗涤细胞3次，每孔加0.25 mL染色液 (按照试剂盒说明书现用现配)，调整 PH为6.0[7]，37℃温箱中孵育过夜。普通光学显微镜下观察，胞质呈蓝色者为阳性细胞，表示细胞处于衰老状态。 -半乳糖苷酶染色阳性率的计算方法为：200倍下每孔中随机选取10个视野，计算阳性细胞总数占总细胞数的百分率。

1.4 细胞周期检测 Ctrl组和UVB照射组末次照射48 h后，吸移培养液，收集细胞悬液，1 500 r/min离心5min，弃去上清液，PBS洗2次，预冷的70%乙醇吹打均匀后重悬，4℃下固定过夜后，PBS洗3次，0.5 mL PBS重悬。加入50g/mL碘化丙啶和1mg/mL的RNA酶，避光37℃孵育30min后流式细胞仪检测。细胞周期的分布使用ModiFit LT v2.0软件进行分析。

1.5 周期相关蛋白检测 正常细胞或SIPS细胞最后一次照射48h后，移去培养液，PBS洗涤3次，加入细胞裂解液500L，提取总蛋白。应用二喹啉甲酸法通过微量紫外分光光度计测定蛋白浓度，变性后取40 g，经10%聚丙烯酰胺电泳分离蛋白并将蛋白质转移至聚偏氟乙烯膜上，孵育袋中加入稀释的 p53、p21(艾博抗1∶500)和 -微管蛋白 -tublin(博士德1∶2000)，4℃孵育过夜。采用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗 (艾博抗1∶2000)室温孵育2h。增强型的化学发光法显影和定影，利用灰度分析法检测蛋白条带的相对蛋白含量。

1.6 统计学分析 采用SPSS13.0统计软件包进行分析，所有数据以均数±标准差（±s）表示，各组间的比较采用方差分析，＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RAPA对小鼠FBs活性的影响 为选择最适宜的RAPA浓度处理细胞并进行实验，分别使用含有不同浓度RAPA的DMEM+10%FBS处理小鼠FBs。发现48h处理时间内，较低浓度的RAPA(0～5mol/L)并不影响细胞活性，而较高浓度的 RAPA(10mol/L)会产生细胞毒性（＜0.05），抑制细胞增殖。因此选择5 mol/L的RAPA作为后续细胞处理药物浓度。见图1。

图1 不同浓度RAPA对小鼠FBs活性的影响

2.2 RAPA降低光老化细胞的衰老染色阳性率 UVB照射组衰老染色明显，主要集中在核周，呈蓝绿色。RAPA预处理后的UVB照射组中阳性染色细胞显著减少，差异有统计学意义（＜0.05），正常细胞组和RAPA处理的正常细胞组鲜有染色。见图2。

图2 UVB照射后SA--Gal染色阳性率

2.3 各组FBs周期 流式细胞仪检测细胞周期后发现UVB照射组S期的细胞比率是Ctrl组的2.2倍，说明UVB照射后的细胞发生了明显的S期阻滞。而UVB+RAPA组细胞处于S期的比率为26.3%，与UVB照射组相比下降了6.5%，差异有统计学意义（＜0.05），可见RAPA预处理可以缓解UVB照射导致的S期阻滞，而RAPA预处理后对Ctrl组细胞的S期没有影响。见图3。2.4RAPA可以降低光老化FBs周期蛋白p53和p21的生成 p53和p21是细胞周期相关蛋白，也是作为细胞衰老的常用指标。Western Blot结果显示与正常细胞组相比，UVB照射组p53和p21的表达量分别是Ctrl组的1.9倍和1.8倍，UVB+RAPA组p53和p21的表达量是Ctrl组的1.4倍和1.3倍，说明RAPA预处理后减少了UVB照射组p53和p21的表达，差异有统计学意义（＜0.05），而RAPA预处理组p53和p21的表达量与Ctrl组比，差异无统计学意义。见图4。

3 讨论

UVB照射可以破坏皮肤的正常结构和功能，并能引起皮肤提前衰老，造成皮肤的粗糙、干燥、皱纹增多以及色素沉着等[8]。真皮的FBs是皮肤的主体细胞，除了衍生真皮外，还可以形成细胞外基质，对维持皮肤的结构、功能以及伤口的修复和愈合起着至关重要的作用[9]。长期暴露在UVB照射下，不仅会导致皮肤老化甚至会诱发皮肤癌[10]。UVB照射可以直接损伤细胞DNA，诱导产生细胞毒性物质（卟啉、胆红素、黑色素、氧自由基和活性氧簇等），造成细胞周期阻滞，干扰细胞的增殖进程，影响的正常细胞功能[11]。

图3 流式检测各组FBs周期

图4 RAPA对UVB诱导的FBs周期相关蛋白表达的影响

细胞内DNA可以直接吸收UVB中的光量子，造成DNA突变和核苷酸结构重排，导致缺陷DNA链的产生，影响DNA的正常复制过程，干扰细胞增殖的正常进程[12]，细胞内的这些改变可以引起包括细胞增殖、分化、老化、周期阻滞及DNA损伤修复在内的多条信号通路激活[13]。而Bhatia-Dey等[14]的研究发现，细胞可以通过周期阻滞来进行DNA修复，是细胞对DNA损伤的一种反馈表现，通过阻滞细胞周期防止细胞DNA的进一步损害。p53和p21等抑癌基因可以调控细胞周期，是激活衰老信号通路的中枢信号[15]。UVB导致的DNA损伤可以激活p53和p21基因，导致视网膜母细胞瘤蛋白的去磷酸化，抑制细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖激酶的合成，使细胞进入一个稳定的周期阻滞期，加剧老化的进程[12,14]。UVB照射可以导致线粒体内产生大量的活性氧簇（reactiveoxygenspecies,ROS），影响细胞内脂质、蛋白质和DNA的合成，干扰细胞间正常的信号通路[16]。p53和p21表达增多可以激活丝裂原活化蛋白激酶和转化生长因子-通路，进一步加速 ROS生成。ROS一方面直接破坏DNA，另一方面可以通过激活核因子appaB和激活蛋白-1等信号通路促进基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）的分泌，MMPs可以降解细胞外基质，破坏细胞的正常结构和功能[17]。在本实验中，UVB照射组发生了明显的 S期阻滞，并且p53和p21蛋白的分泌显著增加也符合细胞衰老的生物学特征，进一步验证了 SIPS模型的合理性。

RAPA是一种大环内酯类化合物，主要用来抑制器官移植后产生的免疫排斥反应。近期研究发现RAPA在改善氧化应激反应和延缓衰老过程等方面发挥着重要作用[18]。RAPA可以通过结合 mTOR受体诱导自噬，吞噬细胞内衰老的蛋白、功能受损的细胞器、代谢废物及过氧化物酶体等来维持细胞的正常功能[18]。已经有实验证明，RAPA可以明显延长哺乳动物的生存期，调控正常的生理衰老进程，机制可能与其诱导的自噬有关[19]。同时Finkel等[20]的研究证明，RAPA预处理后可以减少 ROS和总体炎症因子产生，降低DNA破坏水平，从而减弱辐射对上皮干细胞造成的损伤。而Sonis等[21]发现，RAPA可以通过减少细胞内ROS的生成来降低DNA破坏水平，抑制衰老相关蛋白p53和p21产生，维持细胞周期的正常进行。

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