基质蛋白酶9与慢性阻塞性肺疾病的研究进展

弋可 黄玲

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是一种常见的、严重的呼吸系统疾病，以固定的气道阻塞造成的不可逆的持续性的气流受限和气道中性粒细胞浸润增多为特征[1]。目前，COPD是世界第四大死因，全球超过2亿人受到该疾病的影响[2-4]。尽管在GOLD 2017 关于COPD的定义中删除了慢性炎症，但在病理生理过程的描述中，依然强调了慢性炎症反应。 COPD的慢性炎症过程导致了肺泡壁的破坏从而降低了肺的弹性回缩力，该疾病呈进行性发展，进行性下降的肺功能严重影响患者的生活质量。目前仍然认为炎症反应、蛋白酶-抗胰蛋白酶的失衡、氧化应激反应、自主神经失调和肺的加速衰老等是COPD的主要发病机制。在肺部，弹性蛋白纤维构建了一个薄的多分枝的网络贯穿于整个呼吸树去支持呼吸过程中扩张或回缩的肺泡。基质金属蛋白酶( matrix metalloproteinase, MMPs)以酶原的形式存在，在正常状态下血浆中的浓度很低，但在身体炎症反应加重时，其受到细胞转化因子、炎症细胞因子、体内氧化应激的作用，其浓度明显增加[5]。在不同的细胞通路下，MMPs是一组可以由内皮细胞、平滑肌细胞、支气管上皮细胞、肺泡Ⅱ型细胞、纤维母细胞、Lara细胞等分泌的、锌-钙依赖的能够降解全部的细胞外基质成分的内切蛋白水解酶家族；例如：其通过破坏微纤维和弹性蛋白核心来裂解弹性蛋白，从而使肺泡失去弹性[6]，参与胶原的溶解及促进弹性蛋白酶解离。

MMP-9是MMPs家族中分子量最大的酶，是抗胰蛋白酶的一种，是一个在生化、病理等领域都存在的多功能酶[7]，由中性粒细胞合成并储存到细胞质的部分颗粒中，MMP-9形成于中性粒细胞的成熟后期，在COPD所特有的炎症过程中发挥了重要的作用，有利于中性粒细胞的外渗和分子间隙基底膜的降解(主要包括：Ⅰ型和Ⅳ型胶原蛋白和弹性蛋白[9])，同时也有降解蛋白多糖、核心蛋白的作用[10]。众所周知，MMP-9还有促进组织重建，从而激活和释放生长因子[8]，如血管内皮细胞生长因子A(vascular endothelial growth factora-A, VEGF-A)，能直接诱导肺泡弹性蛋白的降解，这些都能导致胶原蛋白的减少而导致肺气肿。其活动受到组织基质金属蛋白酶抑制剂(tissue matrix metalloproteinase inhibitor, TIMPs)的抑制[11]。其中，TIMP-1能抑制大多数MMPs包括MMP-9，其机制主要是MMPs与TIMPs以1︰1分子比例在Zn2+活性中心接合形成MMPs-TIMPs复合体，这种接合不可逆且稳定性高，故而降低MMPs的浓度，使其与胶原底物的结合减少。同时TIMP-1还具有生长因子样的特性、调控细胞增殖及细胞凋亡等功能，也有研究把MMP-9/TIMP-1作为评估COPD的生物学标志物。

一、MMP-9与固有免疫系统之间的关系

1. 固有免疫系统与COPD的关系: COPD被认为是一个典型的固有免疫系统疾病，吸入的气体及粒子引发炎症反应，促进小气道组织增殖及肺实质的破坏，促进免疫细胞在肺泡间隔的活化。固有免疫应答被病原体、吸入气体及粒子相关分子模式快速激活，这是高度保守的微生物因素[12]。

2. 固有免疫应答通过细胞核因子酉乙蛋白(NF-κB)及Toll样受体2(TLR2)基因管理MMP-9的产生及释放: 固有免疫应答被模式识别受体识别，例如Toll样受体(Toll-like receptors, TLRs)、 CD14、 胶原凝集素[13]。TLR激活触发信号级联放大，导致自身激活和NF-κB的核转位，在COPD的炎症反应程中，细胞核因子酉乙蛋白(nuclear factor unitary B protein, NF-κB)是一个关键的信号分子[13]。NF-κB是 p65和p50的异二聚体，在大多数免疫和炎症反应中扮演着重要的角色，同时管理着MMP-9的生产和促炎细胞因子等的反应和释放，包括肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、IL-1、IL-8等[14]。TNF-α、IL-8是NF-κB有效的催化剂，TNF-α激活IκB激酶复合体(由两个催化亚基IKKα、IKKβ和调节亚基NF-κB基本调节器组成)，激活的IKK随后通过磷酸化抑制NF-κBα的抑制剂(αBκI)导致αBκI的泛素化和降解以达到诱导NF-κB表达的目的。MMP-9的启动子包含NF-κB的结合位点，促进MMP-9基因的表达。因此TNF-α诱导的MMP-9表达的信号通路被认为是参与肺气肿和COPD炎症反应扩大的潜在目的基因, NF-κB同时也可以作为COPD治疗的一个潜在的目的基因。同时TNF-α对TIMPs的诱导具有双向性，当高浓度TNF-α刺激时抑制其产生，低浓度时促进其表达，转化生长因子-β(TGF-β)可以调节MMP-9表达升高，又可以调节MMP-3、1的表达减少，导致细胞外的基质沉积[15]，其系统的调节是复杂的，多因素的。

TLR受体参与病毒诱导的肺部炎症反应，但其具体机制目前还不清楚，COPD患者TLR2基因的表达显示明显增加[16]。在COPD患者的外周血粒细胞TLR2基因的表达、中性粒细胞化学引诱物CXCL8和单核细胞导致的中性粒细胞及固有免疫系统关键介质，包括MMP-9的刺激下，TLR2受体功能显示活跃。 TLR2的刺激会导致来自外周血单核细胞CXCL8、IL-1、IL-6、TNF-α和来自粒细胞的MMP-9的释放增加[9]。中性粒细胞蛋白酶和固有免疫炎症细胞因子的释放也是受到COPD外周血细胞TLR2的刺激，炎症介质的释放在支气管炎症中发挥了重要的作用。这些结果都表明，固有免疫反应在COPD的中性粒细胞性支气管炎中扮演了重要的角色，也提示了激活的TLR2和随后释放的MMP-9可作为管理COPD中的中性粒细胞性支气管炎的关键点。研究表明中性粒细胞包含的白明胶酶颗粒形成于骨髓细胞生成的后期阶段[17]，而且是MMP-9快速胞外分泌的主要的储存部位。年龄相关的中性粒细胞炎症反应的增加被痰嗜中性粒细胞及MMP-9的增加所证明，同时伴随着TLR2基因表达和可溶性TLR2蛋白水平的一道增加。在校正过年龄、吸烟量和气道阻塞的因素后，MMP-9的血浆水平是引起痰中性粒细胞比例显著升高的独立贡献者[9]。根据GOLD分级对COPD患者进行MMP-9的直接检测结果表明，MMP-9的活动程度随着COPD的严重程度的增加而增加。另有结果表明，MMP-9被TIMP-1所抑制，MMP-9/TIMP-1的失调可能也是COPD的发病机制之一[9]。最近一项研究结果显示，在研究MMP-9与流感病毒的发病机理上，MMP-9起着调节中性粒细胞迁移到感染呼吸道起到清除病毒的作用[18]。巨噬细胞表达CD44，研究发现，在胞葬作用(凋亡细胞被吞噬细胞清除的过程称为胞葬作用)的过程中，CD44起着重要的作用，COPD患者肺泡巨噬细胞表面的CD44下降明显，敲除CD44基因的老鼠，出现肺损伤以后，会受到存在胞葬作用清除缺陷的TGFβ释放的炎症反应的破坏，但CD44+的细胞则不会出现这种情况。因此，在肺巨噬细胞CD44表达的减少有可能支持凋亡细胞的继发性坏死，而MMP-9被证明参与并加速了巨噬细胞CD44的脱落[19]。

二、与上皮细胞修复的关系

气道上皮细胞在气道结构和功能的屏障中起着重要的作用，防止吸入的物质进入肺组织、协调固有免疫细胞的活性和获得性免疫系统的感应。暴露于烟草烟雾、过敏原、空气中的悬浮颗粒、病原体、有毒气体及刺激性气体都可以造成气道上皮细胞的损伤，就需要调动修复机制来修复其功能，MMP-9主要在肺上皮细胞和肺实质细胞胞浆内表达，研究者通过明胶酶谱法已观察到支气管上皮细胞培养基的MMP-9[20]。在上皮修复的过程中，转分化的细胞分泌MMP-9，促使细胞下层的粘着斑降解，从而使上皮细胞粘附性降低而导致修复缓慢。此外，失活的MMP-9已经被证明可以减少支气管上皮细胞的迁移[21]。研究发现，COPD的特征性改变不完全可逆的气流阻塞与气道重构有关，主要是由于反复的慢性炎症损伤及气道上皮的不完全修复所致，研究表明，支气管上皮细胞中与气道重构相关的细胞介质，如IL-13、MMP-9以及信号通路、CA2+水平，在机械牵拉应力的作用下显著增加。其机制是通过刺激气道上皮细胞上的瞬时感受器点位1型(TRPC1)从而诱发CA2+的大量涌入及IL-13、MMP-9的释放从而扰乱正常上皮细胞的修复方式。

三、MMP-9的血清浓度用于评估气道阻塞的程度

MMP-9在气道重塑上也发挥了重要的作用，促进弹性组织解离也是肺气肿发生的重要机制。MMP-9是MMPs家族中主要的促弹性组织解离的酶，来源于循环中的单核细胞和中性粒细胞，其通过降解基底膜的Ⅳ型胶原蛋白和其他的基质蛋白来重建和修复组织。MMP-9的血清浓度和气道阻塞的严重程度(FEV1/FVC)呈负相关[22]，但与MMP-9相关的一些分子(包括 TIMP-1 and TIMP-2)都与DLCO%没有显著相关性[23-24]，提示MMP-9与组织重构导致气道阻塞相关而与肺气肿无关。在COPD患者和有症状的吸烟者的比较实验中， MMP-9的单独测量或与血浆中性粒细胞多肽(human neutrophilpeptides, HNP)、中性粒细胞(neutrophile, NE)、 IL-8的组合测量，能够区分患者有无肺功能的障碍及气道阻塞的程度,低比率的MMP-9/TIMP-1也与气道阻塞的程度相关[25]。许多研究都表明MMP-9降解胶原蛋白、弹性蛋白和明胶纤维，与气道阻塞的水平呈负相关[23-25]。MMP-9的浓度改变可作为一个早期呼吸道损伤相关的指标。MMP-9在无症状吸烟者和正在吸烟者在排痰性咳嗽中痰MMP-9浓度也存在正相关[26]，提示蛋白水解的活性增加了COPD患者的支气管炎，研究不仅仅有血浆MMP-9 浓度，还有痰液MMP-9浓度[27-28]，说明MMP-9在局部和全身的炎症反应都扮演了重要的角色。肺气肿早、中、晚期各个组间患者血清MMP-9升高水平并没有显著的差异，但还是可以看出MMP-9对肺组织的破坏作用随着肺功能损伤严重程度的增加而更加明显，提示COPD患者在急性加重期各组血清中MMP-9水平与气道阻塞程度呈正相关。

四、MMP-9其他方面的研究进展

1. 参与皮质类固醇的抵抗及相关治疗前景: COPD在感染下急性加重恶化，且抵抗糖皮质激素，增加治疗困难。研究发现CS和细菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)促进中性粒细胞的活化[29]，在暴露于CS的小鼠组，糖皮质激素与阻挡MMP-9释放的效力有关。支气管肺泡灌洗液中，MMP-9的表达也适当增加，提示了MMP-9参与了皮质类固醇的抵抗。细胞外基质金属蛋白酶诱导物(extracellular matrix metalloproteinase inducer, EMMPRIN)在支气管上皮细胞的表达比肺泡巨噬细胞和血液单核细胞多，EMMPRIN可降低MMP-9中mRNA的表达从而降低MMP-9的活性[30]，虽然目前还不清楚EMMPRIN是通过什么机制使MMP-9降低，但依然为COPD的治疗提供了新的方向。同时，气道重构的核心就是MMPs的表达和调控，第三代高度选择性MMP受体抑制剂和针对MMPs的单克隆抗体都为减轻气道的重塑提供了有价值的治疗方向。

2. MMP-9对于COPD诊断及评估治疗的意义： 用逻辑回归分析数据的方法，回顾分析活化的MMP-9/未活化的MMP-9匹配的数据[31]，结果表明MMP-9与COPD的严重性显著相关，且独立于患者的人口统计学特征、吸烟状况、恶化的肺功能、气道阻塞情况、感染等情况。相关研究还发现了MMP-9的低水平与COPD更高频率的急性加重相关[20]。MMP-9与排痰性咳嗽、下降的FEV1相关，也和转移因子的下降和断层扫描上体现的肺的密度下降有关[32]。在患有COPD的吸烟患者的痰液、肺泡-灌洗液、血液和肺组织都发现了MMP-9的升高，并且上述研究也阐述了MMP-9对于气道阻塞的评估有作用。

研究表明，经过2周维生素D治疗，与治疗前相比较，AECOPD和COPD两组治疗后的MMP-2和MMP-9较治疗前均显著降低[5]，治疗后与治疗前比较均具有统计学意义(P<0.05)。其机制可能为维生素D通过降低基质金属蛋白酶来平衡细胞外基质，从而平衡蛋白酶和抗蛋白酶系统。提示MMP-2和MMP-9参与了COPD的发生与发展，补充维生素D能够抑制基质金属蛋白酶的表达，在COPD发生发展中有重要作用。

虽然关于MMP-9在COPD的发病机制中的作用尚不够明确，但众多研究展开了各方面的探索，为今后更加全面认识COPD奠定了基础。现阶段COPD的诊断主要依靠肺功能。由于其价值的局限性，生物学标志物MMP-9为COPD的诊断提供了新的思路，MMP-9对于COPD患者治疗方案的评估亦有潜在的应用前景。MMPs相关的受体抑制剂和针对MMPs的单克隆抗体也为减轻气道的重塑提供了新的治疗方向。

参 考 文 献

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