高效液相色谱法测定消银软膏中水杨酸的含量

崔业波，马晓静，韩 凤

(四平市食品药品检验所化学室，吉林 四平 136000)

消银软膏为四平市中心医院的医院制剂，主要成分包括升华硫、水杨酸、樟脑及麝香草酚等。目前，该制剂的质量标准只有维生素E和水杨酸的化学反应鉴别。水杨酸为消银软膏的主要有效成分，其为酯溶性有机酸，局部应用可溶解角质，是一种角质软化剂，用于头癣、足癣及局部角质增生。本研究参考相关文献[1-7]，以水杨酸为指标，采用高效液相色谱法测定其含量，现报告如下。

1 材料

1.1 仪器

LC-201AHT型(岛津公司)和Agilent1260型(安捷伦公司)高效液相色谱仪；2450型紫外分光光度仪(岛津公司)；LC-250型(济宁市中区鲁超仪器厂)和SYS5200-T型(上海声源超声仪器设备有限公司)超声波清洗机；BP211D型和BS323S型电子天平(赛多利斯公司)。

1.2 药品与试剂

水杨酸对照品(中国食品药品检定研究院，按C7H6O3计，含量为99.9%，使用前不需要干燥处理，批号：100106—201104)；消银软膏(四平市中心人民医院制剂室，批准文号：吉药制字H20130630，批号：20161201、20161202和20161203)；水杨酸阴性消银软膏(四平市中心人民医院制剂室)；无水乙醇、三氯甲烷为分析纯；甲醇和冰醋酸均为色谱纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为WondaCract ODS-2柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相为水-甲醇-冰醋酸(V∶V∶V=50 ∶50 ∶1)；流速为0.9 ml/min；检测波长为304 nm；柱温为25 ℃；进样量为20 μl。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取水杨酸对照品9.90 mg，置于200 ml容量瓶中，用无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3 供试品溶液的制备

取样品适量(约相当于水杨酸10 mg)，精密称定，置于烧杯中，加三氯甲烷10 ml，超声使溶解，定量转移至200 ml容量瓶中，加无水乙醇适量，超声使水杨酸溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液作为供试品溶液。

2.4 阴性对照溶液的制备

取水杨酸阴性消银软膏，按照“2.3”项下方法制备，即得。

2.5 专属性试验

精密量取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各20 μl，分别注入LC-2010AHT型液相色谱仪中，记录色谱图，见图1。

A.对照品溶液；B.供试品溶液；C.阴性对照溶液A. control solution; B. test solution; C. negative control solution图1 高效液相色谱图Fig 1 HPLC Chromatogram

2.6 线性关系考察

精密称取水杨酸对照品10.34 mg，置于100 ml容量瓶中，无水乙醇使溶解并稀释至刻度，精密量取适量，用无水乙醇分别稀释为15.49、25.82、36.15、51.64、61.98和77.41 μg/ml的系列溶液。按照“2.1”项下色谱条件进样测定，以水杨酸对照品溶液质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，则线性回归方程为Y=43.311X+10.93(R2=0.999 8)。表明水杨酸在15.49～77.41 μg/ml范围内的线性关系良好。

2.7 稳定性试验

取同一供试品溶液，分别于室温(25 ℃)下放置0、2、4、6、8、10和12 h时，精密量取20 μl，按照“2.1”项下方法进样测定，记录水杨酸峰面积。结果表明，10 h内水杨酸峰面积的RSD<1.0%；在12 h时水杨酸峰面积明显减小，RSD为1.4%；故供试品溶液在10 h内稳定性良好。

2.8 重复性试验

精密称取样品(批号：20161202)适量，共6份，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进行含量测定。结果表明，6份样品的含量平均值为106.8%，RSD=0.8%(n=6)，表明重复性良好。

2.9 中间精密度试验

由不同检验员在同一试验室内，采用不同的超声清洗器、电子天平和高效液相色谱仪，精密称取样品(批号：20161202)共6份，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，再按照“2.1”项下色谱条件进行含量测定。结果显示，6份样品的含量平均值为105.8%，RSD=0.5%(n=6)，表明中间精密度良好。

2.10 回收率试验

精密称取水杨酸对照品101.37 mg，置于50 ml容量瓶中，用无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液，备用。精密称取阴性样品约0.2 g，共9份，分别加入上述对照品溶液6、5和4 ml，每个质量浓度水平平行3份，水浴加热至基质与对照品溶液完全融合，放冷，随后按照“2.3”项下方法处理，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算回收率，见表1。

表1 水杨酸回收率试验结果

2.11 耐用性试验

根据“2.1”项下色谱条件，在保持其他条件不变的情况下，分别考察柱温、流速、流动相比例和色谱柱改变时对水杨酸含量测定结果的影响。结果水杨酸的平均含量为105.7%，RSD=0.5%(n=12)，表明耐用性良好，见表2。

表2 耐用性试验结果

2.12 含量测定

取3批样品(批号：20161201、20161202和20161203)，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进行含量测定，采用外标法，以水杨酸峰面积计算含量，结果见表3。

3 讨论

采用UV-2450型紫外分光光度仪分别将对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液，在200～400 nm内进行波长扫描。结果显示，对照品溶液在紫外区的最大吸收波长为303、235和211 nm；阴性对照溶液在200～300 nm之间吸光度较强；而供试品溶液在235和302 nm吸光度较强，且与235 nm比较，302 nm的专属性更强，且阴性无干扰[8-11]。参考《中华人民共和国药典》(2015年版)中水杨酸软膏的测定方法，最终选择304 nm作为检测波长。

参考水杨酸及相关制剂的质量标准[12-13]，考察了流动相分别为甲醇-水-冰醋酸(V∶V∶V=50 ∶50 ∶1)和(V∶V∶V=60 ∶40 ∶1)对高效液相色谱图的影响。流动相为甲醇-水-冰醋酸(V∶V∶V=60 ∶40 ∶1)，保留时间约为10 min，流速为0.6 ml/min时，峰形变宽。因此，选择流动相为甲醇-水-冰醋酸(V∶V∶V=50 ∶50 ∶1)，并调节保留时间约为7 min。

表3 含量测定结果

消银软膏的基质由白凡士林和羊毛脂组成，本研究考察了氯仿和乙酸乙酯的预溶效果。结果显示，加入量为10 ml时，氯仿的溶解效果优于乙酸乙酯。因此，本研究采用氯仿预先溶解，然后用无水乙醇溶解定容。并考虑到白凡士林对色谱柱的影响，通过滤过除去溶液中悬浮的白凡士林作为供试品溶液[14-15]。而供试品溶液放置12 h时，峰面积明显下降，可能是因为水杨酸与处方中的麝香草酚及樟脑成分发生反应，失去双键共轭效应，进而影响水杨酸的峰面积。

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