干细胞胞外囊泡在急性呼吸窘迫综合征中的治疗作用

程婷婷 宋元林

急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是在直接和间接原因触发下免疫系统与肺泡上皮毛细血管屏障相互作用，急性炎症反应引起肺泡上皮细胞及毛细血管内皮细胞损伤，导致肺蛋白通透性增加、弥漫性肺间质及肺泡水肿，进而造成难以纠正的急性低氧血症[1]。目前主要的治疗方式限于肺保护性策略即小潮气量机械通气，治疗效果欠佳，死亡率仍高达40%～70%[2]。

干细胞具有多向分化潜能和强大的旁分泌能力，近年来在ARDS的临床前试验及临床试验中展现出乐观的治疗前景，但也存在诸多问题如治疗剂量选择、给药途径和时间的确定，以及治疗过程中的质量控制、细菌学检测、细胞活性、细胞表型、成瘤性检测等均有待标准化，并可能增加对脓毒症、肿瘤、自身免疫性疾病的易感性[3]。研究表明胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)具有类似干细胞的治疗作用[4]，为ARDS的治疗提供了新的选择可能。本文就干细胞胞外囊泡在ARDS中治疗作用的相关研究进行综述。

一、胞外囊泡概述

胞外囊泡是由脂质双分子层包绕形成的球状膜性囊泡，多数细胞均可分泌产生。根据大小、形态、产生来源、分泌机制不同，胞外囊泡可分为3类：

1. 外泌体(exosomes )： 直径约20～100 nm，是多囊泡核内体与母细胞胞膜融合后释放至胞外形成。表达大量核内体标志如四分子交联体家族成员、热休克蛋白、抗淋巴细胞球蛋白-2反应蛋白X、肿瘤敏感性基因101、MHCI类Ⅱ类分子，以及少量磷脂酰丝氨酸，也常含有膜联蛋白、网格蛋白。外泌体的释放与细胞骨架激活有关[5]。

2. 微囊泡(microvesicles , MVs)(也称核外颗粒体、膜微粒、脱落囊泡等)： 直径100～1 000 nm，从母细胞胞膜直接出芽脱落形成。含大量磷脂酰丝氨酸、胆固醇、脂筏相关蛋白、鞘磷脂和神经酰胺。MV形成依赖于细胞骨架激活和胞内钙离子浓度。

外泌体和微囊泡均可在生理刺激或细胞损伤时由多种细胞类型释放，他们包含有多种细胞组分，包含的蛋白和RNA根据细胞来源及其病理生理状态而不同。可转移生物活性分子(如核内体相关蛋白、膜蛋白、脂质、mRNA、mircroRNA等)驱动细胞间信号通讯[6-7]。

3. 凋亡小体(apoptotic bodies, ABs)： 直径约>1 000 nm，体积接近血小板，由程序性死亡细胞产生，包含有潜在有害或具有免疫原性的细胞组分如DNA片段、非编码RNA、细胞器等，会被吞噬而清除[8]。

胞外囊泡可从体液或体外培养细胞中按照不同的超速离心、超滤、抗体磁珠免疫沉淀等方法分离获得[9]。

二、胞外囊泡的生物学功能及机制

EVs可通过多种途径与受体细胞作用：细胞表面作用、内吞小泡内化、以及胞膜融合等[10]。EVs摄取效率直接与胞内和微环境的酸度有关[11]。EVs表达多种受体和表面分子，包括组织因子、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)、主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)分子、趋化因子受体等，可与靶细胞中的相应配体结合直接作用于靶细胞，如血小板来源的EVs膜富含磷脂酰丝氨酸，为凝血因子的加工提供了表面，在凝血过程中起重要作用[12-13]。EVs可在细胞间传递受体和/或生物活性脂质，如将粘附分子CD41从血小板传递至内皮细胞[14]或肿瘤细胞[15]，从而增加这些细胞的黏附性质；也可传递人免疫缺陷病毒-1的受体CXCR4和CCR5，有助于病毒侵入细胞和病毒播散[12, 16]。EVs可传递胞内蛋白调节靶细胞功能，如内皮细胞来源的EVs可传递促血管生成分子[17- 18]，内毒素刺激的单核细胞Evs可通过传递Caspase-1使血管平滑肌细胞死亡[19]。EVs也可参与基因信息的水平传递，人内皮祖细胞EVs通过将mRNA输送至内皮细胞，激活其血管生成程序[20-22]。并且基因信息交换可是双向的：干细胞来源的EVs可使组织细胞产生表型变化调节细胞再生和分化，损伤细胞释放的EVs也可将特定信号传递给干细胞，触发其分化促进修复[7]。骨髓细胞与损伤的肺细胞共培养后，可接受肺细胞EVs，从而表达肺特异性蛋白如表面活性物质B和C、以及克拉拉细胞特异蛋白[23]。

根据细胞来源的不同，EVs可产生免疫刺激或免疫抑制效应。分枝杆菌感染的肺泡巨噬细胞释放的EVs含有病原驱动的促炎症分子，分泌热休克蛋白70，通过toll样受体激活核因子kB途径，引起促炎因子分泌[12, 24]。树突状细胞EVs可引起清除抗原的体液反应，产生强烈的抗感染作用[25]。间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSC)衍生的EVs可抑制T细胞激活及干扰素-γ 释放，刺激抗炎因子IL-10和转化生长因子β 及产生调节性T细胞[26]，具有免疫调节作用。骨髓MSC及其衍生的EVs在体外也可抑制B细胞增殖。EVs抑制B细胞分化和抗体释放、以及抑制T细胞增殖活性与骨髓MSC相比其作用较差，T细胞、B细胞与骨髓MSC共孵育较与其EVs共孵育产生的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和干扰素-γ水平更低，而IL-10和转化生长因子β 水平更高[27]。

干细胞产生的EVs具有促进组织修复作用，损伤细胞和免疫细胞产生的EVs可使干细胞募集、局部定植干细胞可分化，促进组织修复[28]。MSC来源的EVs可促进巨噬细胞向M2类型转化，改善损伤、促进修复[29]。蛋白组学分析表明，受伤组织耗尽了ATP生成的限速酶，不能利用恢复的氧供产生ATP，这种消耗可被MSC产生的外泌体补充，该外泌体富含具有酶活性的糖酵解酶和其他ATP生成酶，如腺苷酸酶和核苷二磷酸激酶等[30]。

三、 干细胞胞外囊泡在ARDS中的作用

干细胞EVs在ARDS中具有类似干细胞的治疗潜能，其可通过多种作用机制产生肺保护作用。

干细胞Evs可调控ARDS炎症水平。MSC-MVs可减少内皮细胞产生IL-6，增加IL-10[31]，抑制巨噬细胞产生HMGB1和TNF-α，下调iNKT细胞分泌IL-17[32]。在内毒素诱导的ARDS小鼠模型中，人骨髓MSC-EVs治疗有效改善了炎症、降低了支气管肺泡灌洗液中中性粒细胞数量和巨噬细胞炎症蛋白-2的水平，并减少了肺泡蛋白渗出，抑制了肺泡水肿形成，而敲除角质细胞生长因子(keratinocyte growth factor, KGF)mRNA或血管生成素-1的mRNA均可削弱MSC-EVs的治疗作用[33-34]。ARDS患者的支气管肺泡灌洗液中或内毒素处理过的单核细胞来源的肺泡样巨噬细胞可产生大量TNF-α和IL-8，但加入含EVs的MSC条件培养基(conditioned medium, CM)后，巨噬细胞向M2表型转化、产生的TNF-α水平减低。MSC-CM预处理的巨噬细胞可降低支气管肺泡灌洗液蛋白浓度、减少炎症细胞浸润、减轻肺损伤[35]。

MSC-EVs可增强巨噬细胞吞噬细菌的能力。MSC-CM可显著增强人单核细胞来源巨噬细胞的吞噬活性，使具有吞噬性的人单核细胞来源巨噬细胞比例增加(28±5)%，吞噬指数增加9倍[35]。在脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导的ARDS模型中，MSC-CM可通过线粒体转移增强小鼠肺泡巨噬细胞吞噬比例，在体外人单核细胞来源巨噬细胞感染大肠杆菌时，MSC-CM也可通过线粒体转移显著增加巨噬细胞摄取大肠杆菌的数量[36]。而MSC-EVs是否亦可通过其内含有的抗菌肽及抗菌蛋白产生抗菌作用尚有待探讨[37]。

MSC-MVs可显著改善LPS诱导的内皮细胞通透性，增加内皮细胞间连接蛋白VE-钙粘蛋白和闭合蛋白水平，减少内皮细胞凋亡、促进其增殖，该机制依赖于其内的肝细胞生长因子[31]。在失血性休克诱导的ARDS中，MSC-EVs可使细胞骨架重排、降低肺血管通透性[38]。在缺氧损伤模型中，MSC-MVs可阻止中性粒细胞穿越内皮细胞的迁移[32]。

MSC-EVs可通过线粒体转移改善靶细胞能量代谢状态。在内毒素损伤小鼠中，骨髓间充质干细胞的线粒体通过微囊泡方式释放后被受损的上皮细胞摄取，可改善肺上皮细胞能量代谢、恢复肺泡上皮细胞ATP浓度、恢复表面活性蛋白分泌、在ARDS中起保护作用[39]。在内毒素损伤小鼠中，从MSC到肺泡上皮细胞依赖连接蛋白43的线粒体转移可恢复表面活性蛋白分泌、恢复肺泡上皮细胞ATP浓度、提高生存率[36]。MSC-CM可通过将有功能的线粒体转移至肺泡巨噬细胞中，使其氧化磷酸化增强，进而调节其表型转换，但此作用可被ATP合酶抑制剂所阻断[35]。

MSC-EVs可抑制ARDS中TGFΒ1诱导的纤维母细胞向肌纤维母细胞分化，抑制纤维化形成[40]。在博莱霉素诱导的肺损伤中，Ⅱ型肺泡上皮细胞系衍生的外泌体miR-371b-5p可促进Ⅱ型肺泡上皮细胞存活和增殖，促进损伤肺泡的上皮细胞再生[41]。

MSC-EVs可抑制禽、猪流感、人流感病毒感染所致的ARDS中红细胞凝集反应，可抑制流感病毒复制和病毒诱导的肺上皮细胞凋亡。在猪的流感病毒模型中，气道内注入MSC-EVs可显著减少鼻拭子脱落的病毒、肺部的流感病毒复制和肺内促炎症细胞因子的产生。组织病理学结果显示，MSC-EVs可减轻猪流感病毒引起的肺损伤[42]。

此外，干细胞外泌体可作为天然的基因传递载体。文献报道体细胞重组的人诱导多能干细胞纯化的外泌体可将siRNA传递至人肺微血管内皮细胞[43]，抑制细胞间粘附分子-1蛋白表达及由LPS诱导的多形核细胞-内皮细胞的粘附[44]。

四、干细胞胞外囊泡应用的问题

与干细胞相比，EVs具有许多优势，如归巢能力好可避免在其他器官中不需要的累积，没有免疫原性可避免免疫排斥，非自我复制、产生肿瘤可能性小，避免细胞静脉注射引起肺栓塞可能[45]。已有干细胞EVs在1型糖尿病疾病(NCT02138331) 、急性缺血性脑卒中(NCT03384433)中的Ⅰ期临床研究[4]。越来越多的证据表明干细胞EVs(包括外泌体、MVs或干细胞CM)有望作为无细胞治疗应用于ARDS患者。但EVs的作用机制仍待进一步研究，如哪些信号调节了生物活性分子的转移、哪些表面受体可能产生选择特异性、哪些刺激可触发EVs释放等尚不明确，了解这些机制有助于EVs作为诊断标志、作为药物和基因载体、以及作为新的治疗手段[46]。应用于临床前尚有许多问题有待解决：如临床应用需要大规模扩增，如何通过不同的预处理改变EVs成分和表型，从干细胞中分离纯化EVs的方法有待优化，EVs内的RNA、mircoRNA、脂质、蛋白成分鉴定复杂，干细胞EVs在呼吸系统疾病中的生物分布、EVs治疗的长期效果等均需进一步研究[4, 45- 46]。干细胞胞外囊泡应用于ARDS的临床治疗尚任重而道远。