循环肿瘤细胞及其在乳腺癌诊疗中的应用研究进展

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(郑州大学附属肿瘤医院病理科，河南 郑州 450008)

近年来，中国女性乳腺癌发病率和死亡人数逐年增高，北京等城市乳腺癌的增长率达到了5%，已然发展成为威胁我国女性健康的最常见肿瘤之一[1]。导致乳腺癌难以治愈的主要因素是肿瘤的转移，提高对肿瘤转移的监控甚至寻找一种能够抑制肿瘤转移的方法成为近年来研究的热点。现已证实，肿瘤细胞能够从原发肿瘤上脱离出来或由于其他一些医疗操作的原因进入血液循环系统，虽然在肿瘤细胞的转移过程中，大部分肿瘤细胞被机体的免疫系统所拦截并消灭，但是还是会有一部分肿瘤细胞能够生存下来[2]，并且形成转移灶，此类肿瘤细胞被称为循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)[3]。CTCs与乳腺癌患者的预后、临床分期、总生存期以及肿瘤的转移均密切相关[4]。本文将从CTCs的生物学特征、筛选和检测技术以及临床研究现状方面综述乳腺癌CTCs的相关研究。

1 CTCs生物学特征

1.1CTCs基因研究研究[5-6]表明，对单个CTCs进行全基因组测序并对特定的基因突变进行分析，有利于进行针对性治疗，改善治疗方案，减少对患者不必要的化疗。Heitzer等[7]对37例结肠癌患者CTCs的基因突变进行分析研究后发现，CTCs的某些染色体组与原发灶存在不一致性，这表明了我们可以通过CTCs监测肿瘤基因的动态变化。此外，Schneck等[8]在对44例乳腺癌患者的研究中也证实了这一现象。

1.2CTCsRNA研究CTCs RNA分析有3种常用途径[3]：1)将捕获的CTCs破碎后提取RNA，然后将其应用于逆转录，进一步分析与肿瘤相关的转录组；2)应用RT-qPCR或RNA测序获取CTCs生物信息；3)将原位杂交技术和生物探针相结合对CTCs进行分析，从而评估CTCs间异质性以及得到其他生物信息。

1.3CTCs蛋白研究抗体免疫染色法是对CTCs的蛋白进行研究的主要方法，对CTCs蛋白研究的局限性在于CTCs富集率低，许多针对蛋白组学的研究方法并没有应用到对CTCs蛋白的研究中来。

随着近年来对CTCs的基因、RNA、蛋白等研究的深入，CTCs的分子生物学特征及其在肿瘤转移中的功能研究逐渐被科研人员所关注。

1.4CTCs功能研究功能分析目前主要针对异种移植和试管内培养所产生的CTCs[3]。2015年，Cayrefourcq等[9]发现新培育出的结肠癌CTCs能够加速去免疫小鼠活体瘤的形成，并且能够诱导内皮细胞在试管内生长。Yu等[10]建立CTCs与异种移植相结合的方式培育出了新生肿瘤，并对其进行研究，随后发现了潜在的治疗靶点。

2 CTCs的筛选和检测技术

近年来，随着对CTCs的研究越来越深入，许多CTCs筛选检测技术相继出现，目前最常用的CTCs分离方法可以分为2大类，即物理分离法和生物分离法[11]。

物理分离法是利用CTCs与其他外周血细胞的大小、形状、密度、等电点等物理条件的不同加以分离。传统的方法包括密度梯度离心法和膜滤过分离法[12]，主要包括OncoQuick分离法、聚蔗糖密度梯度离心法、ScreenCell分离法等。近年来研发的物理分离法主要包括介电电泳技术、多孔流分离技术、流式细胞术等。有研究[13]利用流式细胞术进行CTCs检测，实验结果表明，应用流式细胞术检测乳腺癌患者外周血中CTCs具有较高的敏感性和特异性。

生物分离法是根据CTCs的表面抗原与其他外周血细胞表面抗原不同，利用免疫学方法对其加以分离的。生物分离法的代表就是常用的CellSearch系统，也是目前惟一被美国FDA批准用于前列腺癌、转移性乳腺癌和结肠癌预后判断的CTCs分离系统[14-16]。另外，还包括RT-PCR技术和体内CTCs检测技术等。

CTCs被分离富集后，再借助免疫细胞荧光染色技术和高分辨率成像技术鉴别富集后的细胞[17]。总体来说，物理分离法较生物分离法操作更为简便，能够保护CTCs的生物活性，不影响对其生物活性的检测，价格方面也比较低廉，但是物理分离法不具备特异性，可能会漏检一部分直径较小的肿瘤细胞；生物分离法具有较高的敏感性和特异性，有很好的可重复性，但是有些方法可能会对CTCs造成破坏，例如RT-PCR法需要对CTCs进行破碎，检测其mRNA，因此，无法对CTCs进行形态学观察和计数[17]。

3 乳腺癌CTCs临床研究进展

随着对乳腺癌CTCs研究的深入，人们发现在外周血中检测到CTCs预示着可能发生肿瘤转移，血液中CTCs的计数可以作为乳腺癌、结肠癌等的独立预后因素[13]。Bidard等[18]对20个研究中1 944例转移性乳腺癌患者的临床合并数据分析，结果发现这是CTCs数量变化对患者预后情况影响的有力支撑。研究结果表明，患者在接受新一轮的治疗前，CTCs计数≤5个/7.5 mL的患者相比CTCs计数≥5个/7.5 mL的患者的总体生存期和无进展生存期要长。CTCs在外周血中的数量在一定程度上影响着肿瘤患者的预后情况，同时根据治疗前后CTCs的水平也能反映出治疗方案在肿瘤治疗上的效果。单海琳等[19]对100例中晚期乳腺癌患者外周血中CTCs数目与化疗疗效和预后相关性试验中发现，外周血CTCs检测可用于中晚期乳腺癌的化疗疗效评价和转移检测，具有对预后状况预测的价值。现已证实，早期乳腺癌CTCs检出率与组织学分级、肿块大小、激素受体等无关，与患者人体表皮生长因子受体2(HER2)的表达明显相关，CTCs检测可作为预测乳腺癌患者治疗反应的一个重要指标[20]。

乳腺癌患者外周血CTCs阳性率与HER2、Ki-67表达与否有关，还与TNM分期有关，而与月经状态、雌激素受体、孕激素受体表达与否无关[21]。但是也有与TNM分期等无关的报道[22]。已有研究[23]证明，在早期或转移性乳腺癌中，外周血CTCs数量≤5个/7.5 mL的患者中，免疫荧光技术检测的HER2水平的评估并不可靠。

4 展望

随着近年来对乳腺癌CTCs研究的深入，CTCs已经被证实可以作为一个有力的预后因素，此外，其在疗效评价和指导临床治疗中也有一定的临床价值。由于缺乏临床实用性，所以要将CTCs检测作为常规检查应用于临床还为时尚早，有许多问题还未解决，例如不同的CTCs检测仪器检测结果间存在差异，我们应该以哪一种仪器检测结果为标准等。待检测CTCs细胞表达的上皮生物标志物还非常有限，现有的CTCs检测技术还不能高效特异检测出外周血中CTCs的数量，这也是CTCs检测不能作为临床常规检查的原因之一。但其具有的临床价值是不可否认的，相信随着科研工作者们的不懈努力，CTCs相关技术会得到极大的进步，也将会为肿瘤研究事业的进步提供更有力的支持。