重症肌无力模型的研究进展

唐毅华 章正祥⋆ 李净娅 蒋旭宏 侯群 裘昌林

作者单位：310053 浙江中医药大学第一临床医学院（唐毅华）310006 浙江中医药大学附属第一医院（章正祥 李净娅 蒋旭宏 侯群 裘昌林）

重症肌无力（Myasthenia Gravis，MG）是由自身抗体引起的，表现为肌无力，易疲劳，活动后加重等特点的神经肌肉接头疾病。根据患者血清抗体的差异，可分为抗乙酰胆碱受体（AchR）抗体、抗骨骼肌特异性酪氨酸激酶（MuSK）抗体及抗低密度脂蛋白受体相关蛋白4（LRP4）抗体等10余种抗体。MG的发病机制复杂，建立合适的动物模型是研究和防治MG的关键。本文按抗体分型对MG模型的制备方法、原理及造模的关键因素等进行总结，以期为今后探索出更接近人MG疾病特征的动物模型提供参考。

1 实验动物的选择

1.1 种属 目前最常用的动物为大鼠和小鼠［1］。通过对T-AchR诱导MG的各种属及近交种系比较发现，鼠的行为改变与人发病的表现最为相似，且已有相对成熟的技术对鼠进行转基因和基因敲除等处理，同时鼠较猪等大型动物所需的免疫剂量更少。不同种系的鼠类临床表现有所差异，大鼠较小鼠可出现额外的急性反应期及更严重的肌无力症状。且Lewis大鼠与人MG表现最相像，Fischer和Wistar Munich大鼠的进展最快、表现最严重［2］。

1.2 年龄 Hoedemaekers A等曾在Brown Norway大鼠的主动免疫模型中证实8～10周龄大鼠对AchR诱导最为敏感，＞100周的大鼠对AchR诱导具有明显抵抗性［3］。该年龄相关性也在被动免疫模型中被证实，主要原因为雌性Lewis大鼠从9周龄开始易感肌肉中的rapsyn表达量随年龄增加而增加，rapsyn的数量变化在保护AchR免受抗原调节起一定作用［4］。

1.3 性别和体重 慢性实验性自身免疫性重症肌无力（EAMG）血清诱导可使老年雌鼠AchR降低40%～50%，而雄鼠则无AchR数量改变，该现象表明雌性大鼠较雄性大鼠更易诱发MG［3］。另外，体重决定自身抗体有效的胞外浓度，是突触传递过程中的另一决定因素。因此，建议使用7周龄雌性Lewis大鼠诱导主动免疫模型；10～12周龄雌性Lewis大鼠诱导被动免疫模型［5］。其他可选用的鼠高致敏品种还有：C57BL6/J，SJL和AKR，诱导成功率在50%～70%。

2 MG的动物模型制备

2.1 AchR诱导的MG模型 肌肉型乙酰胆碱受体分布于骨骼神经肌肉接头的后突触及电鳐的发电器官，是神经传导过程中的一种重要化学信号。据统计，约85%的全身型MG患者、50%眼肌型MG患者体内产生乙酰胆碱受体抗体（AchR-Ab）［6］，是MG最主要的自身抗体。AchR诱导的MG模型是最经典也是研究最深入的动物模型。（1）AchR诱导的主动免疫MG模型：AchR诱导的主动免疫MG模型是利用注入的AchR或人工合成肽段产生主动免疫应答。免疫过程可分为急性期与慢性期2个阶段：急性阶段开始于免疫7d内，该阶段抗AchR抗体（IgM型）大量合成，诱导肌膜上的补体沉积，神经肌肉接头上广泛的吞噬细胞入侵致使突触后膜破坏，使肌肉AchR含量迅速减少［7］。但在接下去的2～3d内，AchR含量异常增加可产生更多额外的AchR。慢性进展期大约开始于免疫后28d，其特征为突触后膜上产生更大量的抗体（IgG型）和补体沉积。与健康动物相比，该阶段无吞噬细胞且骨骼肌AchR含量的降低至1/3［8］。AchR诱导的主动免疫模型与人的发病进程相似，具有较高的可行性。但因该模型需要2～3次增强免疫，对小鼠确定合适的时间窗预防和治疗MG造成一定困难。目前主要的造模方法有：①电鳐AchR诱导的MG模型：从电鳐的电器官分离纯化乙酰胆碱受体后，与含有结核分枝杆菌的弗氏完全佐剂充分混合，在实验大鼠的足垫、腹部及背部皮下多点注射乳剂。用类似方法再行2～3次增强免疫［9］。该方法虽可产生明显的肌无力症状，但AchR的提取非常困难且纯化过程涉及安全问题。②人工合成肽段诱导MG模型：常用的人工合成肽段有α97-116肽段、α125-147肽段、α129-145肽段等。实验步骤为将人工合成肽段、佐剂、PBS按1：1.5：1.5比例混合，用与电鳐AchR诱导的同样方法进行2～3次免疫［10］。人工合成肽段诱导的EAMG与电鳗AchR诱导的EAMG相比，其病程进展缓慢，临床表现更复杂多样。③人工提取TE671细胞中的AchR诱导MG模型：孙辰倩等通过TE671细胞获得人骨骼肌AchRα1亚基的全长cDNA，然后通过PCR重组表达人乙酰胆碱受体α1亚基胞外域蛋白，成功诱导出EAMG［11］。（2）AchR-Ab诱导的被动免疫 MG 模型（PTMG）：该模型为直接将乙酰胆碱受体抗体注入鼠类，鼠在注射抗体的48h内即可出现典型的肌无力症状［12］。该方式不能检测靶向淋巴细胞及细胞因子表达或抗原识别的治疗剂量，也不会诱发慢性自身免疫性疾病［13］。被动免疫造模方式有：①被动转移MG患者或慢性EAMG鼠血清中的AchR-Ab［9］；方法为用加热器照射腹部注射部位，使腹部血管舒张，手提起腹部皮肤，用小型注射器缓慢将MG患者或慢性EAMG鼠的血清注入小鼠腹部静脉或腹膜内。由于MG患者及慢性EAMG鼠血清中存在各种免疫蛋白及炎症介质，模型制备过程存在较大干扰，不能保证单因素影响，现已较少使用。②被动转移AchRa亚基单克隆抗体［9］；诱导IgG1和IgG2a亚类的AchRa亚基单克隆抗体后［14］，将单克隆抗体注入小鼠腹膜内。该方法的成模率较高，成模速度快，但因临床症状消失快，不符合人类的患病特点，未被广泛应用。（3）将人MG胸腺组织移植入SCID小鼠［15］；切取确诊MG的人胸腺瘤组织1cm3，将组织植入自身免疫缺陷的SCID小鼠的肾被膜下，在移植的1～2周后即产生明显的肌无力症状。但因移植步骤复杂，对无菌条件及实验者的操作水平要求高，在实际操作中存在一定困难。

2.2 MuSK诱导的MG模型 MuSK抗体阳性的MG多表现为颈、肩等局部肌肉受累［14］。现已在大约40%的乙酰胆碱受体抗体阴性的MG患者中检出MuSK抗体［16］。这种MuSK-Ab阳性亚型的血清阴性患者，称之为抗MuSK肌无力（AMM）。MuSK诱导的MG模型实验方法为以小鼠MuSK基因编码序列为模板合成小鼠MuSK抗原，采取主动免疫方法将小鼠MuSK抗原（100μg）与弗氏完全佐剂混合制成抗原乳剂，注射至Lewis大鼠尾根部皮下或腹膜内［17］。该方法无需加强免疫。最近Verschuuren JJGM等也通过纯化MuSK MG患者IgG4的方式成功诱导出PTMG［18］。

2.3 LRP4诱导的MG模型 LRP4与MuSK激活，乙酰胆碱受体的聚集及神经肌肉接头的形成密切相关。其主要通过单体集聚蛋白与LRP4相互作用形成二元复合物，协同促进四聚体形成，从而影响运动神经元末梢释放集聚蛋白诱导的AchR聚集，是抗AchR和抗MuSK抗体双重阴性MG的重要发病机制［19］。

shen C［20］、Barik A 等［21］曾用含有完整细胞外结构的LRP4重组蛋白与完全佐剂乳化进行主动及加强免疫成功诱导出EAMG。同时对B6小鼠注入LRP4抗体进行被动免疫也可出现肢无力症状。Canan Ulusoy等［22］对几个近交种系分析，推荐B6为LRP4-EAMG易感小鼠品系。

2.4 Agrin诱导的MG模型 2014年Zhang B等［23］通过MG患者血清标本分组研究提出Agrin是AchR、MuSK及LRP4三重抗体阴性的MG患者的又一致病抗体。最近MinYan等通过Agrin的主动免疫诱导再次证实该结论。其实验步骤参考2013年shen C通过LRP4诱导MG 模型的具体方法。作用机理可能为抗N集聚蛋白抗体可阻断Agrin与LRP4的相互作用并因此损害MuSK的活化从而诱发MG［24］。目前尚无AChE及Titin成功诱导的MG模型，需进一步研究。

3 造模成功的关键因素

制备成功的动物模型是研究MG机制的前提，结合已有研究影响造模的主要因素有：（1）老鼠的种系及个体差异性：不同种系老鼠的易感性不同，现推测不易产生肌无力的老鼠在神经肌肉接头内可产生更多的乙酰胆碱，但该猜想尚未证实。（2）诱导抗原与佐剂的种类与剂量：不同大鼠品系主要组织相容性单倍型的T细胞可识别不同的AchR肽，而EAMG模型中用于调节针对不同特定AchR表位的免疫应答方法可受到不同大鼠品种主要组织相容性复合体的影响，故不同类型的AchR片段诱导动物模型的成功率不同［22］。同时，AchR与佐剂剂量也会影响疾病进展、发病率和严重程度。如使用高剂量的强效佐剂在加重MG表现的同时也会使动物死亡数增加，但小剂量的佐剂又不能引起明显的肌无力表现［25］。结合已有研究，建议使用40μg tAchR进行免疫接种［5］。（3）是否加入辅佐佐剂：辅助佐剂主要有：结核分枝杆菌、百日咳博德特菌等。辅助佐剂可使免疫反应更强烈。可能的作用机制为结核分枝杆菌、百日咳博德特菌感染明显激活TLR信号传导途径以触发先天性免疫反应，随后弗氏完全佐剂触发适应性免疫反应以抑制感染［26］。但因百日咳博德特氏菌产生的肌细胞破坏和单核细胞浸润等病理特征与人MG不同，故不推荐使用百日咳博德特氏菌［27］。结核分枝杆菌可诱导EAMG急性期的发生［28］，即在注射后7～10d可观察到小鼠短暂的肌无力。且增加辅佐佐剂的浓度可导致EAMG的发病率及严重程度增加，但因高浓度辅助佐剂（2mg/ml）可使动物的临床缺陷比例增加，故推荐使用含1mg/ml结核分枝杆菌的弗氏完全佐剂进行免疫［26］。（4）特异性抗体与大鼠乙酰胆碱受体反应少：主动免疫可产生大量AchR抗体，但只有＜1%的抗体能与大鼠自身AchR发生免疫反应［5］。（5）抗原注射部位：推荐的部位为脚垫、腹部及尾部。研究发现使用脚垫注射可增加EAMG的发病率，但因该方法会增加动物的痛苦及足部疼痛引起的评估误差，故国外常使用单纯尾部注射［26］。（6）注射物质的吸收程度：免疫动物注射部位发生化脓、溃疡、皮炎及佐剂性关节炎等均可引起接种物质吸收不良，使动物免疫反应减弱［29］。该问题尚无解决方法，国外多采用增加动物数量来增加造模成功率［5］。

4 MG模型的评估方法

MG动物模型的各评价指标是评估造模成功与否的另一关键因素。结合已有文献及人MG的检查项目，主要通过动物体重及肌力等临床表现变化、AchR抗体等浓度及滴度检测、肌电图等电生理改变、骨骼肌等病理形态学的观察进行评估。但MG模型的评估方法虽多但不统一，尚未探索出一套客观的、根据发病机制和根本变异参数指标的衡量标准。

5 小结

EAMG的临床表现、药理学、电生理、免疫学等方面已被证明与MG患者极为相似，是进一步研究人类MG的极佳工具。目前造模的方式虽多但成功率相差却较大，影响造模成功的关键问题仍未完全被人类所解决。因此，成功制备EAMG 模型仍是医学工作者亟待解决的问题。