靶向NS4B抑制剂安非合韦的有关物质测定

陶 鑫 袁 红 焦丹丹

(常州寅盛药业有限公司，江苏 常州 213003；*苏州大学附属儿童医院，江苏 苏州 215000)

慢性丙型肝炎是由丙肝病毒(HCV)引起的一种传染性疾病。目前国际国内研究较多的为NS5A、NS5B、NS3/4这三个靶点，针对NS4B的小分子抑制剂的开发起步较晚，目前没有相关的药物在临床研究阶段。2008年，斯坦福大学的研究人员发现了第一个HCV NS4B抑制剂克立咪唑(Clemizole)，该化合物可通过干扰NS4B的富精氨酸区域(arginine rich motif, ARM)与病毒负链RNA的相互作用而抑制病毒的复制[1]。但由于化合物明显的细胞毒性及细胞水平的低活性(基因型2a复制子EC50=8μM)，使其终止于Ⅰ期临床。在2010年，斯坦福大学的研究人员报道了另一个NS4B抑制剂Anguizole，该化合物可通过与蛋白质第二个双亲螺旋(4BAH2)作用，抑制脂质囊泡的聚集，从而抑制病毒的复制[2,3]。随后，以此结构出发，葛兰素史克进行大量的结构优化发现了高活性的NS4B抑制剂[4,5]，而在2013年，PTC[6,7]、Pharmasset[8]及Gilead公司[9]也相继报道了具有相同机制的NS4B抑制剂。但这些药物由于口服吸收差等问题均已停止临床开发。

我公司开发的安非合韦为苯并呋喃类的全新的具有自主知识产权NS4B抑制剂，该药物已在中国获批临床并正在开展临床试验。因此，安非合韦目前是针对丙肝NS4B靶点的唯一一个临床阶段的药物，若获批生产，将成为First-in-class的药物。本文建立了安非合韦有关物质的检测方法。

1 仪器与试药

安捷伦1260 液相色谱仪带紫外检测器(G1314F)和DAD双检测器，G1316A柱温箱，EZChrom色谱工作站。安非合韦自制对照品(含量99.38%)，安非合韦(批号为201403-03-141207, 201403-03-141208，201403-03-141209，由常州寅盛药业有限公司生产)；纯化水；乙腈为色谱级；磷酸为国产分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

采用Thermo BDS HYPERSIL C18(4.60×250 mm, 5.0 μm色谱柱，用等度洗脱的方式，流动相0.1%磷酸水溶液∶乙腈=5∶5，照中国药典高效液相色谱法的要求进行检测。检测波长为210 nm，柱温40 ℃，流速1.0 mL·min-1，进样体积10 μL。系统适应性测试为在平衡色谱系统后，基线应有最小的噪音和漂移，按照空白1针，对照溶液(ST)5针，杂质对照溶液(IMPST)1针，样品溶液(SP)1针，对照溶液(ST)1针的顺序进行分析，对照溶液主峰的理论塔板数应不得低于3000，对照溶液中主峰拖尾因子应不大于2.0，六针对照溶液中主峰的峰面积RSD应不大于2.0%。

2.2 溶液配制及检测

取安非合韦供试品30 mg，精密称定，放入100 mL容量瓶中，加稀释液(乙腈∶水=5∶5)溶解并稀释至刻度，混匀即得浓度为0.3 mg·mL-1样品溶液。照色谱条件，自动进样10 μL，记录色谱图，按面积归一化法计算。稀释剂空白色谱图谱见图1，安非合韦样品图谱见图2。

图1 稀释剂空白色谱图Fig 1 Chromatogram of Blank

图2 安非合韦样品色谱图Fig 2 Chromatogram of Amphihevir API

2.3 专属性

称取适量样品，分别加入酸(1 mol/L盐酸)、碱(1 mol/L氢氧化钠)和氧化(30%双氧水)1 mL，置80 ℃水浴中加热1 h，取出冷却至室温，用稀释液溶解并定容至刻度。分别称取高温(60℃)、高湿(92.5RH%)、强光(4 500 Lx±500 Lx)下5 d，10 d的适量样品，用稀释液溶解并定容至刻度。分别将6种不同条件破坏后制备的样品按选定的色谱条件，进样10 μL，考察安非合韦的杂质专属性。结果显示安非合韦与降解物质均能较好的分离，且主峰峰纯度均为0.95以上，没有包裹杂质。酸、碱、氧化破坏见色谱图3～5，高温、高湿和强光破坏10天的色谱图见图6～8。

图3 安非合韦酸破坏(1 mol/L盐酸)色谱图Fig 3 Chromatogram of Amphihevir degraded by acid (1N hydrochloric acid solution)

图4 安非合韦碱破坏碱(1 mol/L氢氧化钠)色谱图Fig 4 Chromatogram of Amphihevir degraded by alkali (1N sodium hydroxide solution)

图5 安非合韦氧化破坏碱(30%双氧水)色谱图Fig 5 Chromatogram of Amphihevir degraded by oxidation (30% H2O2 solution)

图6 安非合韦高温(60 ℃，10 d)破坏色谱图Fig 6 Chromatogram of Amphihevir degraded by high temperature (60 ℃，10 days)

图7 安非合韦高湿(92.5RH%，10 d)破坏色谱图Fig 7 Chromatogram of Amphihevir degraded by high humidity (92.5RH%，10days)

图8 安非合韦强光(4 500 Lx±500 Lx，10 d)破坏色谱图Fig 8 Chromatogram of Amphihevir degraded by highlight (4 500 Lx±500 Lx，10 days)

2.4 定量限和检测限

配制多个较低浓度水平的安非合韦溶液，分别进行检测，当信噪比为3左右即确定为检测限，当信噪比为10左右即确定为定量限。测得的结果显示，安非合韦检测限位0.008 99 μg·mL-1，定量限为0.029 98 μg·mL-1。

2.5 重复性及中间精密度

通过一份样品，重复进样6针检测确认测定方法的重复性，并由另一个操作者重复进样3针，共9针确认安非合韦有关物质测定方法的中间精密度。本品有关物质方法的重复性RSD为0.01%，中间精密度RSD为0，重复性和中间精密度良好。

2.6 溶液稳定性

配制一份供试品溶液，将该溶液在常温下分别放置不同的时间，分别按照选定的色谱条件进样，记录谱图，以此来考察溶液的稳定性。安非合韦主峰峰面积的RSD为0.61%，样品在24 h内稳定。

2.7 方法耐用性

通过改变不同HPLC条件如流速、柱温、流动相配比来评估测定条件有微小的变动时，判断结果受影响的程度，以此来判断方法的耐用性。结果显示，流速为0.9～1.1 mL·min-1，流动相0.1%磷酸水溶液∶乙腈配比变化为4∶6或6∶4，理论塔板数均大于18 000，拖尾因子均小于1.078，分离度均大于3.0，均符合检测要求，方法耐用性良好。

2.8 样品的测定

按照HPLC有关物质的测定方法，分别对常州寅盛药业有限公司生产的三批中试规模样品进行了测试，批号为批号为201403-03-141207, 201403-03-141208，201403-03-141209，3批样品纯度分别为99.53%，99.44%和99.43%，最大单个杂质分别为0.15%，0.15%和0.21%。最大单杂和总杂均符合临床申报质量标准的要求。

3 讨 论

3.1 安非合韦有关物质的方法开发

波长的选择：对安非合韦合成工艺的起始原料、中间体及成品均进行了DAD全波长扫描，考察了各已知杂质组分的吸收波长，安非合韦的最大吸收在220 nm左右，主要起始原料和中间体的最大吸收在205 nm左右，但是考虑到205 nm波长处基线不稳，综合考虑决定选择210 nm作为有关物质的检测波长。

色谱柱的选择：通过改变色谱柱型号，根据理论塔板数和拖尾因子来判定柱子的选择。筛选了依利特、Waters、Thermo和Kromasil的C18柱，由测试数据可知，选用Thermo C18、KromasilC18色谱柱时，各峰理论塔板数均高于其他色谱柱，分离度也较好，因此可选用Thermo C18、KromasilC18色谱柱作为检测所用色谱柱。

3.2 后续方法开发

安非合韦属于1.1类创新药物，目前处于临床阶段，尚未对杂质进行全面研究。在后续开发中，我们将按照ICH指南、CDE相关药学研究指南和中国药典的要求，争取最大程度减少工艺中超过0.1%限度的杂质，若超过，则对杂质进行鉴定研究以及必要的毒理学研究。本文的研究可为后续方法开发提供一定的理论基础，并为创新药物的质量标准研究提供一些参考。

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