L/MGE神经干细胞移植对神经系统疾病的治疗

马全红

笔者的主要研究方向为AD与自闭症，本文主要讲述神经干细胞在这两种疾病中的治疗与应用。AD是一种神经退行性疾病，其临床症状主要表现为学习、记忆能力下降，后期会出现逻辑思考能力的下降，晚期则可能出现一定的语言障碍。AD存在两种病理性标志物，一个是位于细胞外的β淀粉斑块，另一个是位于细胞内的神经纤维缠结，β淀粉斑块主要由 β-淀粉样蛋白 （amyloid β-protein，Aβ）积聚导致，神经纤维缠结则是由Tau过度磷酸化形成。这两种病理标志物不仅是AD诊断的标志，其过度积聚，特别是Aβ的过度积聚，还可以导致神经炎症、神经退行性病变、突触丢失及记忆丢失等一系列神经症状。因此过去20年来，以Aβ为靶点的药物是AD领域的主要研发内容，但近几年发现该类以Aβ为靶点的药物临床试验在晚期都以失败告终。有专家认为导致的失败的原因是药物干预时间太晚，但研究表明，即使在早期就进行药物干预，其结果亦是失败的，因此人们开始考虑Aβ靶点药物治疗以外的治疗策略。

干细胞移植在神经退行性疾病的治疗中展现了不错的疗效，目前神经退行性疾病领域内普遍性进行移植的干细胞种类包括诱导性多能干细胞、胚胎干细胞、间充质干细胞和神经干细胞。其主要移植机制：（1）细胞替代机制，移植的干细胞可直接在脑内分化疾病缺损或丢失的神经细胞；（2）旁分泌机制，移植的干细胞可以通过释放神经营养因子起到细胞保护的作用；（3）促进内源性干细胞再生；（4）可起到免疫调节的作用。移植干细胞治疗神经系统疾病的过程中有一些问题是需要注意的。首先，在脑内存在多种亚型的神经元，按功能分为兴奋性锥体神经元和抑制性中间神经元，该两类神经元的数目需保持一定的比例，否则会造成兴奋性/抑制性失衡，进而导致多种神经系统疾病，如AD、自闭症、癫痫等，因此干细胞移植治疗神经系统疾病时需要针对特异疾病受损或缺失的细胞类型。如果疾病属于兴奋性椎体神经元缺失，那么移植入的神经干细胞应该主要针对缺失的兴奋性椎体神经元；如果是兴奋性/抑制性神经元失衡导致的疾病，则应注意改善神经疾病患者脑内兴奋性/抑制性神经元失衡的状况。

研究发现，AD患者发生癫痫的几率高于正常人。对AD患者及AD模型小鼠进行脑电图监测时发现其神经网络的兴奋性均增加，即存在超兴奋性。研究结果表明，AD模型小鼠出现癫痫样棘波的频率是明显增加的。在前期的研究中，笔者对AD模型小鼠中间神经元的数量进行检测发现，虽然AD模型小鼠在4个月时就开始出现β淀粉斑块，但其中间神经元数量明显减少并未出现在早期，而是发生在7 ～12个月时，且AD模型小鼠出现认知障碍也是发生在7 ～12个月时。由此我们提出以下问题，AD患者脑内的抑制性中间神经元丢失是否是其认知障碍的基础？移植中间神经元是否能改善AD患者的认知障碍，尤其是疾病发展后期的认知障碍？这一点是非常重要的，因为多数AD患者在确诊时已经在疾病发展后期了。

笔者通过对小鼠胚胎期的观察发现，在小鼠侧脑室背侧存在一群神经干细胞，主要产生脑内兴奋性的椎体神经元；在小鼠侧脑室腹侧的神经干细胞，则主要产生抑制性 γ-氨基丁酸（γ-amino-butyric acid，GABA）能中间神经元。在实验中我们将该部分的神经干细胞进行分离和纯化，外/内侧神经节隆起区（Lateral/medial ganglionic eminences，L/MGE）神经干细胞的鉴定结果提示其可以分化为抑制性的中间神经元。对L/MGE神经干细胞分化能力检测发现约70%的L/MGE神经干细胞可分化为GABA能中间神经元，约50%可分化为小白蛋白阳性的神经元，说明L/MGE神经干细胞是可以分化为GABA能中间神经元的。将L/MGE神经干细胞移植到7个月大的AD小鼠模型中，1周后经染色发现L/MGE神经干细胞在移植后是可以很好地存活的。笔者还对L/MGE神经干细胞进行了迁移研究，发现1周后其在移植点附近并没有很好地迁移，但在2个月后可观察到L/MGE神经干细胞很好地迁移到了海马区周围，说明L/MGE神经干细胞具备良好的迁移能力。另外，移植后L/MGE神经干细胞分化为各亚型的GABA能神经元，移植后3个月，约60%的神经干细胞分化为GABA能神经元，20%的神经干细胞分化为各亚型的GABA能中间神经元。但研究发现，移植后的L/MGE神经干细胞并不能分化为星形胶质细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞，说明L/MGE神经干细胞不具有分化胶质细胞的能力。

那移植干细胞是否能改善AD模型小鼠的认知障碍？笔者对此进行了一项重要试验。AD模型小鼠在4个月时开始出现β淀粉斑块，7个月时出现认知障碍，同时出现中间神经元的丢失。与其他研究不同的是，本研究未在4个月时对AD模型小鼠进行干预，而是在7个月其发展出严重的认知障碍时进行L/MGE神经干细胞的移植，因为本研究主要针对的AD晚期患者治疗而进行的实验。移植后2个月对AD模型小鼠进行行为学检测，发现AD模型小鼠与正常小鼠在水迷宫实验和新物体识别实验中具有相同的行为学表现，提示L/MGE神经干细胞移植可有效改善AD模型小鼠的认知障碍。

那干细胞移植是通过何种机制来改善AD模型小鼠认知障碍的呢？研究发现，移植L/MGE神经干细胞并未改变AD模型小鼠脑内β淀粉斑块密度，移植后AD模型小鼠脑内星形胶质细胞和小胶质细胞的密度都没有得到抑制，说明干细胞移植并不能改变AD模型小鼠脑内的神经炎症。同时，研究发现移植L/MGE神经干细胞对AD模型小鼠神经突触的密度也无太大影响。但检测移植L/MGE神经干细胞后AD模型小鼠的超兴奋性，发现对比其之前癫痫样棘波频率明显增加的表现，在干细胞移植后其癫痫样棘波出现的频率是明显下降的，说明L/MGE神经干细胞可有效改善AD模型小鼠脑内的超兴奋性。为进一步确定干细胞移植对认知障碍的影响，笔者进行了一项长时程增强 （long term potentiation，LTP）相关的研究，这是利用电生理的方式反映小鼠的学习记忆能力比较可靠的指标。AD模型小鼠中的LTP是受到抑制的，但移植L/MGE神经干细胞后，其LTP是明显增加的，这说明移植L/MGE神经干细胞能够有效改善AD模型小鼠受抑制的LTP。

移植L/MGE神经干细胞即使在AD发展的后期，脑内依旧存在大量Aβ积聚情况下，仍能改善AD的认知障碍。L/MGE神经干细胞移植是通过改变AD脑内的兴奋性/抑制性失衡来改善AD的认知障碍的。虽然大多AD患者的诊断发生在中晚期，但移植L/MGE神经干细胞依旧是治疗AD非常好的方案。同样，笔者对自闭症家族遗传学筛选发现，TRIM32是自闭症的危险性遗传基因。自闭症主要表现为社交障碍、重复性行为和狭窄兴趣，常伴随认知能力损害、多动、癫痫和感知功能异常等症状。对小鼠行为学进行测试发现，TRIM32缺失可导致小鼠出现社交障碍，同时导致L/MGE神经干细胞增殖减少，GABA能神经元产生障碍，最终造成GABA能中间能神经元数量减少。通过电生理检测发现，TRIM32缺失可导致GABA能抑制障碍，出现神经超兴奋性。而移植L/MGE神经干细胞在TRIM32 KO小鼠脑内可分化为各亚型的GABA能神经元，改善TRIM32 KO小鼠脑内的超兴奋性及社交障碍。综上，移植L/MGE神经干细胞不仅可有效治疗AD，其对自闭症的治疗效果也是非常好的。