番木瓜环斑病毒西瓜株系衣壳蛋白的原核表达及抗血清制备

黄显德+王玉+田延平+古勤生+李向东

摘要：以感染番木瓜环斑病毒西瓜株系（papaya ringspot virus-watermelon strain，PRSV-W）的西葫芦叶片为供试材料，通过RT-PCR克隆PRSV-W衣壳蛋白（coat protein，CP）基因，并将其连接到原核表达载体pEHISTEV上得到重组质粒pEHISTEV-PRSV-W-CP。将其转化大肠杆菌Rosetta，经IPTG诱导后可表达分子量约为37 kD的融合蛋白。将融合蛋白从凝胶中切下，乳化后免疫新西兰长耳兔，制备PRSV-W CP的抗血清。间接ELISA测定该血清效价为1∶8192。Western blot检测结果表明，该抗血清只与感染PRSV的西葫芦样品有特异性反应，而与健康西葫芦、感染西瓜花叶病毒的西葫芦及感染马铃薯Y病毒的普通烟样品均无反应。本研究为PRSV的快速检测以及CP蛋白功能的研究奠定了基础。

关键词：番木瓜环斑病毒西瓜株系；衣壳蛋白；原核表达；抗血清制备；检测

中图分类号：S436.5：Q78文献标识号：A文章编号：1001-4942（2017）12-0086-04

Abstract The coat protein （CP） gene of papaya ringspot virus-watermelon strain （PRSV-W） was amplified by RT-PCR from infected zucchini leaf samples and cloned into the prokaryotic expression vector pEHISTEV to produce recombinant plasmid pEHISTEV-PRSV-W-CP. The recombinant plasmid was transformed into Escherichia coli strain Rosetta and expressed a fusion protein with molecular weight of 37 kD after induction with IPTG. The fusion protein was cut from the gel， emulsified and used to immunize the New Zealand rabbits to produce polyclonal antiserum against the CP of PRSV-W. The titer of the resultant antiserum was 1∶8192 in ELISA. In Western blot analysis， the antiserum showed specific positive reaction only with the zucchini plants infected with PRSV， but not with healthy zucchini plants or those infected with Watermelon mosaic virus， or Nicotiana tabacum plants infected with Potato virus Y. This research laid foundations for the detection of PRSV and functional studies of PRSV CP.

Keywords Papaya ringspot virus-watermelon strain； Coat protein； Prokaryotic expression； Antiserum preparation； Detection

番木瓜环斑病毒（Papaya ringspot virus，PRSV）是危害葫芦科（Cucurbitaceae）作物和番木瓜（Carica papaya L.）的重要病毒[1]，可导致番木瓜减产85%～90%，严重的甚至绝收，给西葫芦、南瓜、黄瓜、西瓜等葫芦科作物的生产也造成严重危害。自20世纪40年代末在美国首次报道以来[2]，目前在巴西、印度、波兰等国均有该病毒病发生的报道[3，4]。2000—2001年，PRSV给海南番木瓜造成不可估量的损失。2005年以来，在广东、四川等地检测到PRSV侵染罗汉果、苦瓜等葫芦科作物[5]。2016年，我们从山东西葫芦上检测到PRSV[6]。

PRSV属于马铃薯Y病毒科（Potyviridae）马铃薯Y病毒属（Potyvirus），根据寄主可划分为P和W两个株系，其中P株系侵染番木瓜和葫芦科作物，而W株系只侵染葫芦科作物[7]。两者血清学反应密切相关。我们分离到的PRSV属于W株系。PRSV病毒粒子弯曲线状，无包膜，约（760～800） nm×12 nm，基因组为正单链RNA，全长约10.4 kb，通过多聚蛋白策略编码2个多聚蛋白，后加工形成11个成熟蛋白[7， 8]。

衣壳蛋白（coat protein，CP）是一种多功能的结构蛋白，在病毒的复制、移动及传播，寄主症状表现等过程中均发挥着重要作用[9，10]。本研究构建了能高效表达PRSV-W CP的原核表达载体，并通过免疫新西兰长耳兔制备了PRSV-W CP的特异性抗血清，为PRSV的检测以及其CP蛋白功能研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

感病样品采自山东济南感染PRSV-W的西葫芦叶片，通过摩擦接种保存在西葫芦植株上。原核表达载体pEHISTEV由英国安德鲁斯大学刘焕庭老师惠赠，大肠杆菌菌株DH5α、Rosetta由本实验室保存。

反转录酶、RNA酶抑制剂、Taq DNA聚合酶、限制性内切酶、T4 DNA连接酶、dNTP、无RNA酶的水均购自TaKaRa公司；Phusion DNA聚合酶购自Thermo公司；植物总RNA提取试剂盒TransZol、DNA凝膠回收试剂盒、质粒小提试剂盒购自北京全式金公司；硝酸纤维素膜为Pall Gelman公司产品；碱性磷酸酯酶标记的羊抗兔IgG、辣根过氧化物酶标记的鼠抗兔IgG、福氏不完全佐剂购自Sigma公司；其它试剂为进口或国产分析纯。endprint

根据本实验室测定的PRSV-W全序列（序列号MF085000）设计引物扩增PRSV-W CP基因，由上海生工生物工程有限公司合成。正向引物为PRSV-W-CP-NcoⅠ-F：5′-CATGCCATGGTCTAAAAATGAAGCTGTGGACGCT-3′，下划线部分为NcoⅠ酶切位点；反向引物为PRSV-W-CP-BamHⅠ-R：5′-CGCGGATCCTCAATTGCGCATACCCAGG-3′，下划线部分为BamHⅠ酶切位点。

1.2 试验方法

1.2.1 基因扩增及原核表达载体构建 参照TransZol试剂盒说明，提取感病西葫芦叶片总RNA，以此为模板，利用随机引物进行反转录合成第一链cDNA。利用引物PRSV-W-CP-NcoⅠ-F和PRSV-W-CP-BamH Ⅰ-R，以cDNA为模板进行PCR，扩增CP基因。PCR反应程序：98℃预变性30 s；98℃变性10 s，65.7℃退火20 s，72℃延伸30 s，30个循环；72℃延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离，纯化回收后用Nco Ⅰ和BamHⅠ双酶切，与同样酶切处理的pEHISTEV用T4 DNA连接酶连接。连接产物转化E. coli DH5α感受态细胞。将PCR验证和酶切鉴定的阳性克隆送济南博尚公司测序验证。

1.2.2 目的蛋白的诱导表达和SDS-PAGE分析 将测序正确的重组质粒（pEHISTEV-PRSV-W-CP）转化E. coli Rosetta。挑取单菌落接种于5 mL LB液体培养基中（含50 mg/L卡那霉素），37℃培养过夜。第二天按1∶100稀释于20 mL含50 mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200 r/min振荡培养至OD600值为0.4～0.6。将菌液分为两份，一份加入IPTG使其终浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L，于28℃、150 r/min诱导4 h；另一份加入IPTG使其终浓度为0.4 mmol/L，于28℃、150 r/min分别诱导1、2、3、4、5、6 h。12 000 r/min离心2 min收集菌体，加适量TE缓冲液（pH 8.0）振荡悬浮，再加入等体积2×SDS上样缓冲液，100℃煮沸5 min，-20℃放置5 min，12 000 r/min离心10 min，取上清进行SDS-PAGE电泳。

1.2.3 抗血清制备、效价及特异性测定 通过SDS-PAGE分离原核表达产物，用0℃的0.25 mol/L KCl 和1 mmol/L DTT染色，切取目的蛋白条带，按1∶1（W/V）加入0.9%生理盐水在预冷的研钵中研磨。采取皮下多点注射免疫新西兰大耳兔，初次免疫所用目的蛋白要加入等体积的弗氏完全佐剂进行乳化，之后改用弗氏不完全佐剂。每隔一周注射一次，首次免疫计量为1 mg，之后加强免疫计量为0.6 mg，免疫4次。最后一次免疫后7天耳缘静脉取血，测效价。效价达到要求后心脏取血，分离血清，加入0.02%的叠氮化钠于-20℃保存。

利用ACP-ELISA法测定抗血清效价：将感病西葫芦样品和抗原包被缓冲液（0.05 mol/L碳酸盐缓冲液，pH 9.6）按1∶10（W/V）的比例加入研磨袋充分研磨，用研磨液包被酶联板。以同样的方法处理健康叶片作为阴性对照。抗血清按照1∶26～1∶214进行梯度稀释。显色后使用酶标仪读取405 nm的OD值，I（待测样品读数-空白读数）/ H（阴性样品读数-空白读数）≥3为阳性反应。

参照Towbin等[11]的方法进行Western blot，分析抗血清的特异性。以感染PRSV-W的西葫芦叶片为检测对象，以健康西葫芦叶片为阴性对照。提取蛋白进行SDS-PAGE电泳后电转至NC膜上，放置5%脱脂奶粉溶液中4℃封闭过夜。按1∶500加入所制备的抗血清，孵育、洗涤后放入HRP-鼠抗兔IgG稀释液中（1∶50 000稀释）。将HRP-ECL化学发光所用A、B发光液按1∶1混合后，覆于NC膜上，在ChampChemi全自动化学发光仪中观察结果。同时以感染西瓜花叶病毒（WMV）的西葫芦叶片以及感染马铃薯Y病毒（PVY）的普通烟叶片为对照，检测抗体的特异性。

2 结果与分析

2.1 PRSV-W CP基因克隆及原核表达

利用引物PRSV-W-CP-NcoⅠ-F和PRSV-W-CP-BamHⅠ-R进行PCR扩增，得到870 bp的CP基因片段。PCR产物回收后用NcoⅠ和BamHⅠ双酶切，与同样酶切处理的原核表达载体pEHISTEV进行连接，得到重组质粒pEHISTEV-PRSV-W-CP。通过PCR扩增和核苷酸序列测定证明其开放阅读框正确。

将测序正确的重组质粒转化E. coli Rosetta。菌液经不同浓度IPTG和不同时间诱导后进行SDS-PAGE电泳，发现在37 kD附近出现一条特异性蛋白条带（图1、2），与理论预期大小一致，说明PRSV-W CP在大肠杆菌中得到了正确表达。当 IPTG诱导1 h时蛋白即可表达，随着时间增长表达量有所增加，在诱导4 h以后表达量无明显变化（图1）；在IPTG浓度梯度中，当其浓度为0.2 mmol/L时蛋白即可表达，随着IPTG浓度的升高表达量无明显变化（图2）。说明，IPTG浓度为0.2 mmol/L、诱导4 h为PRSV-W CP高效表达条件。

2.2 抗血清制备及效价测定

从SDS-PAGE凝胶中切下pEHISTEV-PRSV-W-CP的原核表达产物，乳化后免疫新西兰大耳兔4次，获得PRSV-W CP抗血清。以感染PRSV的西葫蘆叶片样品和健康叶片为材料，通过ACP-ELISA测定所得抗血清效价（表1），当病汁液稀释10倍，抗血清稀释8 192倍时仍呈现明显的阳性反应，表明该抗体效价较高。endprint

2.3 抗血清特異性检测

将得到的抗血清通过Western blot分析特异性。结果显示，仅PRSV-W侵染的西葫芦样品在35 kD处出现了特异性条带，而健康西葫芦叶片、PVY侵染的普通烟叶片及WMV侵染的西葫芦叶片均无特异性反应（图3），说明该抗血清能够特异地与PRSV-W CP发生免疫反应。

3 讨论与结论

PRSV作为危害葫芦科作物和番木瓜的主要病毒，对其生产造成了严重损害，因此建立一种快速可靠的检测技术对于控制该病毒病的传播和蔓延十分重要。血清学方法具有灵敏、快速、适合大量样品检测等特点，在植物病毒检测中应用广泛。由于PRSV病毒粒子细长，其外壳蛋白在提纯过程中容易断裂或聚集，与寄主杂质粘结而丢失，因而提纯较为困难[12]。利用原核表达的方法可以在短时间内获得大量的目的蛋白，成为制备抗血清常用的方法[13]。

本研究利用E. coli Rosetta成功表达了PRSV-W CP，并通过免疫新西兰大耳兔制备了特异性强、效价高的抗血清。该抗血清可用于Western blot和ELISA等对PRSV进行检测。原核表达过程中重组菌能否诱导表达以及诱导后表达产物得率高低是制备抗体的关键，因此对诱导时间和诱导物浓度进行了梯度分析。考虑到成本及IPTG对细胞有毒性等问题，最终确定IPTG浓度为0.2 mmol/L、诱导4 h为PRSV-W CP高效表达条件。在这一条件下，诱导产物得率高，时间短，为后续免疫程序奠定了良好基础。本研究制备的抗血清为检测PRSV和CP功能研究奠定了基础。

参 考 文 献：

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