独活寄生汤对膝骨关节炎大鼠关节软骨基质的影响

陈 俊 ，吴广文 ，黄云梅 ，叶锦霞 ，郑春松 ，邱建清 ，刘淑如 ，刘献祥

（1.福建中医药大学，福建 福州 350122；2.福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福建 福州 350122）

独活寄生汤对膝骨关节炎大鼠关节软骨基质的影响

陈 俊1，吴广文1，黄云梅2，叶锦霞2，郑春松1，邱建清1，刘淑如1，刘献祥1

（1.福建中医药大学，福建 福州 350122；2.福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福建 福州 350122）

目的 观察独活寄生汤对膝骨关节炎（KOA）大鼠软骨基质的影响，探讨独活寄生汤治疗KOA的作用机制。 方法 2月龄清洁级雄性SD大鼠80只，喂养1周后分为正常组20只和造模组60只。造模组分别在第1、4、7天右膝关节腔注射0.2 mL 4%木瓜蛋白酶。成功造模后，造模组分为模型组、治疗组和对照组各20只。正常组、模型组按照 10 mL／（kg·d-1）的剂量灌服生理盐水；治疗组按照 9.3 g／（kg·d-1）的剂量灌服独活寄生汤；对照组按照0.15 g／（kg·d-1）的剂量灌服奥泰灵。2周为1个疗程，共治疗4个疗程。每2个疗程后，处死一批动物，腹主动脉采血，ELISA法测定Ⅱ型胶原 C端肽（CTXⅡ）和Ⅱ型胶原C前肽（CPⅡ）；取右侧胫骨平台于4%多聚甲醛中固定、包埋，甲苯胺蓝染色观察糖胺聚糖变化；Masson染色观察胶原变化。 结果 与正常组比较，模型组糖胺聚糖含量减少，Ⅱ型胶原表达降低，CTXⅡ显著升高（P＜0.05），CPⅡ显著降低（P＜0.05）。治疗组治疗后，糖胺聚糖含量增加，Ⅱ型胶原表达增加，CTXⅡ含量降低（P＜0.05），CPⅡ含量升高（P＜0.05）。 结论 独活寄生汤可通过抑制软骨基质主要成分丢失，有效减轻KOA大鼠关节软骨基质破坏。

膝骨关节炎；软骨基质；糖胺聚糖；Ⅱ型胶原；独活寄生汤

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是指关节退行性改变，以致关节软骨破坏而引起的一种慢性关节疾病。研究［1］发现软骨基质代谢异常与关节软骨破坏紧密相关。独活寄生汤源于唐·孙思邈《备急千金要方》，临床广泛用于 OA 的治疗，疗效显著［2］，但其作用机制不明。本研究拟通过复制膝骨关节炎（KOA）大鼠模型，从软骨基质角度探讨独活寄生汤对KOA的干预作用，以期为独活寄生汤临床运用提供理论依据。

1 实验材料

1.1 实验药物 独活寄生汤由独活9 g，桑寄生6 g，牛膝 6 g，杜仲 6 g，秦艽 6 g，防风 6 g，肉桂 6 g，细辛 6 g，川芎 6 g，当归 6 g，芍药 6 g，干地黄 6 g，人参6 g，茯苓6 g，甘草6 g组成，使用时用蒸馏水煎煮，浓缩至浓度为3 g／mL，-20℃保存备用。奥泰灵（盐酸氨基葡萄糖，香港澳美制药厂），使用时用蒸馏水配制，浓度为2.269 g／mL，4℃冰箱保存备用。

1.2 实验动物 80只雄性SD大鼠［上海斯莱克实验动物有限责任公司，合格证号：SCXK（沪）2012-0002］。实验动物处理方法参照《关于善待实验动物的指导性意见》执行。

1.3 实验试剂 甲苯胺蓝染色液、masson染色试剂盒（石家庄德萨生物科技有限公司）；Ⅱ型胶原C端肽和Ⅱ型胶原C前肽检测试剂盒（美国R&D公司）。

1.4 主要仪器 生物组织石蜡包埋机（湖北孝感市亚光医用电子技术有限公司）；全自动石蜡切片机（上海徕卡仪器有限公司）；Image-ProPlus多功能真彩色图象分析管理系统（美国Media Cybernetics公司）；Elx800通用酶标仪（美国Bio-Tek公司）。

2 实验方法

2.1 动物分组与模型制备 健康2月龄清洁级雄性SD大鼠80只，适应性喂养1周，采用随机数字表法分为正常组20只和造模组60只。正常组不做任何处理。造模组在第1、4、7天右膝关节腔注射4%木瓜蛋白酶复制膝骨关节炎模型［3］。造模2周成模后［4］，按随机数字表法将造模组随机分为模型组、治疗组和对照组各20只。各组大鼠给药剂量换算参考文献［5］，正常组、模型组按照 10 mL／（kg·d－1）的剂量灌服0.9%生理盐水，治疗组按照9.3 g／（kg·d－1）的剂量灌服独活寄生汤，对照组按照 0.15 g／（kg·d－1）的剂量灌服奥泰灵。

2.2 组织取材与处理 治疗4周和8周后，分批处死动物，腹主动脉采血，ELISA法测定Ⅱ型胶原C端肽（collagen typeⅡC-telopeptide，CTXⅡ）和Ⅱ型胶原 C 前肽（typeⅡprocollagen C-propeptide，CPⅡ）；取右侧胫骨平台于4%多聚甲醛中固定、包埋，甲苯胺蓝染色观察糖胺聚糖变化；Masson染色观察胶原变化。

2.3 ELISA法检测血清中CTXⅡ、CPⅡ含量 具体实验步骤参照试剂盒说明书。

2.4 糖胺聚糖甲苯胺蓝染色 连续治疗4周和8周，麻醉成功后，切取右侧胫骨平台于4%多聚甲醛中固定48 h，EDTA脱钙8周，进行常规石蜡包埋。石蜡包埋的组织切片常规脱蜡脱水，0.1%甲苯胺蓝染色30min，流水冲洗1min，冰醋酸溶液中于显微镜下分色数秒；蒸馏水洗2次，各2min；染色后进行乙醇梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，镜下观察。

2.5 Masson胶原染色 采用2.4中的组织包埋块，切片常规脱蜡至水，用配制好的Weigert铁苏木素染色5～10 min；酸性乙醇分化，水洗；Masson蓝化液返蓝，蒸馏水洗1 min；丽春红染色液染色5～10 min，磷钼酸溶液洗1～2 min，弱酸工作液洗1 min；苯胺蓝染色1～2 min，弱酸工作液洗1 min；常规乙醇梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，镜下观察。

2.6 统计学方法 运用SPSS22.0统计软件分析。计量资料符合正态分布的以（x±s）表示，2组比较采用t检验，多组数据比较采用单因素方差分析；等级资料采用秩和检验。

3 结 果

3.1 各组治疗后血清CTXⅡ和CPⅡ比较 见图1。

图1 各组治疗后血清CTXⅡ和CPⅡ比较

3.2 Masson染色 正常组中关节软骨组织结构清晰，软骨胶原呈绿色，染色均匀（图2A、图2B）。模型组中软骨胶原染色脱失严重，潮线向上升起的火焰状红色增多（图2C），随着时间推迟，红色明显增多（图2D）。治疗组和对照组软骨绿色脱失减轻，潮线向上升起的火焰状红色明显减少（图2E、图2F），提示胶原性质的改变及Ⅱ型胶原减少程度降低［6］；随着治疗时间的延长，红色进一步降低（图2G、图2H），治疗组与对照组间无明显差别。

3.3 甲苯胺蓝染色 由图3A、图3B可见：正常组中细胞排列整齐、规则，软骨基质异染呈紫蓝色，且染色深、面积大，软骨下骨染色浅。模型组染色深度和面积均下降，有些部位出现大面积失染（图3C）；随着时间的延长，软骨基质染色的深度和面积进一步降低；细胞排列紊乱、不规则（图3D）。治疗组治疗后，染色深度和面积均明显提高，细胞排列较模型组规则（图3E）；随着治疗时间的延长，染色深度和面积进一步提高（图3F）。对照组治疗后，染色深度和面积明显提高，细胞排列较模型组规则，与治疗组比较，无明显差别（图3G、图3H）。

图3 各组胫骨切片甲苯胺蓝染色图（×200）

4 讨 论

OA基本病理改变是多种致病因素引起进行性关节软骨变性、破坏，其中，关节软骨基质破坏将导致软骨降解，最终造成关节软骨的破坏［7］。软骨基质由软骨细胞合成并分泌，主要由Ⅱ型胶原和蛋白多糖组成［8］。在骨关节炎中，软骨细胞合成和分泌Ⅱ型胶原能力降低，但合成和分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原能力提高［9］。Masson染色方法可显示软骨胶原的改变，正常关节软骨系Ⅱ型胶原，呈蓝绿色，钙化软骨和软骨系Ⅰ型胶原呈红色，OA关节软骨从潮线向上升起很多火焰状红色。本研究提示独活寄生汤和奥泰灵治疗OA具有一定的时间依赖。

当前，许多学者也采用生物标记物来评估骨关节炎软骨损伤程度，而在已知的标记物中，Ⅱ型胶原（collagen typeⅡ）是评价骨关节炎的重要标志物，CTXⅡ和CPⅡ作为Ⅱ型胶原降解、合成标志物，其变化可反映软骨损伤程度［10］。本研究进一步证实独活寄生汤和奥泰灵均可抑制Ⅱ型胶原的降解、促进其合成，从而减缓软骨退变。但治疗组和对照组同期比较，无显著性差异（P＞0.05）。

甲苯胺蓝可将软骨基质中的糖胺聚糖异染呈紫蓝色，其机制是甲苯胺蓝阳离子与酸性基团结合，导致吸收光谱改变。本研究表明独活寄生汤和奥泰灵均可以促进软骨细胞分泌糖胺聚糖，促进损伤软骨的修复，2组疗效无明显差别。

综上可知，独活寄生汤可抑制软骨基质主要成分Ⅱ型胶原和蛋白多糖的丢失，有效减轻膝骨关节炎大鼠关节软骨基质破坏，对关节软骨具有一定的保护作用，

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R285.5

A

1000-338X（2017）06-0024-03

2017-10-08

国家自然科学基金资助项目（81573801）；福建省自然科学基金杰青项目（2017J06018）；2017年度福建省中医药科技项目（2017FJZYJC204）

陈俊（1986—），女，医学硕士，讲师，主要从事中西医结合防治骨关节炎研究。

刘献祥（1963—），男，教授，博士生导师。E-mail：liuxianxiang@163.com