沉默UHRF1对乳腺癌细胞增殖和转移的影响

2018-01-09 02:49孔艺然
实用肿瘤学杂志 2017年6期
关键词:乳腺癌活性蛋白

陈 琢 孔艺然

沉默UHRF1对乳腺癌细胞增殖和转移的影响

陈 琢 孔艺然

目的探讨UHRF1对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖以及侵袭的影响及其相关机制。方法采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT)检测沉默UHRF1基因后对乳腺癌MDA-MB-231细胞活力的影响;应用克隆形成实验检测沉默UHRF1后对乳腺癌MDA-MB-231细胞存活的影响;吖啶橙-溴乙锭(AO/EB)检测沉默UHRF1后对乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡的影响;Caspase-3活性试剂盒检测沉默UHRF1后乳腺癌细胞Casapse-3活性的变化;Western blot法检测细胞中凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Bad、p-Bad、XIAP、p53、p21Cip1/Waf1和p16INK4a的表达;应用Transwell实验研究沉默UHRF1对MDA-MB-231细胞侵袭能力的影响;Wound Healing实验研究沉默UHRF1后对其迁移能力的影响。结果沉默UHRF1使乳腺癌MDA-MB-231细胞活力降低;克隆形成实验结果显示沉默UHRF1后MDA-MB-231细胞存活能力降低,AO/EB染色显示沉默UHRF1促进MDA-MB-231细胞凋亡。同时Caspase-3活性实验结果显示沉默UHRF1后乳腺癌MDA-MB-231细胞Caspase-3的活性增加;Western blot结果显示,沉默UHRF1后,能够使凋亡蛋白Bad、XIAP和Bax的表达上调,同时抗凋亡蛋白p-Bad,Bcl-2的表达下调,也使p53,p21Cip1/Waf1,p16INK4a蛋白表达升高;Transwell以及Wound Healing实验证明沉默UHRF1能够抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭和迁移。结论沉默UHRF1能够抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞活力和存活,并抑制乳腺癌MDA-MB-231的侵袭和迁移。沉默UHRF1通过调控p53,p21Cip1/Waf1,p16INK4a信号发挥作用。

UHRF1;乳腺癌;p53;侵袭;凋亡

乳腺癌(Breast cancer)是世界范围内女性较常见的恶性肿瘤之一[1]。尽管目前临床对于乳腺癌的治疗主要集中于手术和放化疗[2-3],但因其对患者的损伤大,术后对于女性心理以及生理的影响巨大[4]。因此,进一步研究乳腺癌的致病因素和发生机制,明确靶向治疗方向[5],是目前困扰广大学者的重要研究问题。UHRF1,也被称为ICBP90,属于UHRF家族[6]。UHRF1被发现在前列腺癌[7]、膀胱癌[8]和乳腺癌[9]中过量表达,但是其确切的生物学功能仍然被学者们所关注。文献报道[10]体外实验中UHRF1基因可能是一种生长调节基因,其主要作用在于能够抑制细胞有丝分裂从而对细胞增殖产生影响,进而对细胞周期进行调节。然而,关于UHRF1对乳腺癌细胞增殖的具体影响鲜有报道。本研究主要探讨沉默UHRF1后,乳腺癌细胞系MDA-MB-231增殖以及迁移能力的变化,及其初步机制。

1 材料与方法

1.1 材料

人乳腺癌细胞系用RPMI-1640(含10%小牛血清)培养基于37℃、5% CO2条件下培养。UHRF1-shRNA购自中国Gene Pharma公司。抗Bcl-2、抗Bax、抗Bad、抗p-Bad、抗p53,抗p21Cip1/Waf1以及p16INK4a单克隆抗体购自美国Cell Signaling公司。

1.2 方法

1.2.1 分组 将正常对照组,NC组以及UHRF1-shRNA组分别转染到MDA-MB-231细胞中(NC组:阴性对照组;UHRF1-shRNA组,转染UHRF1-shRNA 48 h后的MDA-MB-231细胞),Western blot方法检测转染后UHRF1蛋白的变化,发现NC组与正常对照组相比没有统计学差异(P=0.0923),因此在后续的实验中,本研究以NC组为对照组(图1A)。

1.2.2 MTT法测定MDA-MB-231细胞生长抑制率 将2×103L-1的MDA-MB-231细胞接种于96孔板中,贴壁培养24 h后,分别向MDA-MB-231细胞中转染UHRF1-shRNA及NC 48 h后,MTT法测定细胞的吸光度值。

1.2.3 Caspase-3活性检测 向MDA-MB-231细胞中转染UHRF1-shRNA,48 h后,按照Caspase-3活性检测试剂盒说明书测定Caspase-3的酶活性。

1.2.4 Western blot检测细胞中凋亡相关蛋白的表达 总蛋白是从转染UHRF1-shRNA及其NC 48 h后MDA-MB-231细胞中提取。使用12%的SDS-PAGE胶,每个孔道蛋白样品50 μg,浓缩胶70 V,分离胶110 V后,将蛋白转印至醋酸纤维素膜上,300 mA转印1.5 h后,在5%的脱脂牛奶中封闭2 h。分别将不同的抗体p16INK4a、p21CIP1/WAF1、p53、Bcl-2、Bax、Bad、p-Bad、XIAP、β-actin在4℃恒温摇床上孵育过夜,红外荧光染料标记的第二抗体室温孵育1 h。Western blot通过奥德赛3.0软件进行红外成像系统采集,以相应蛋白条带的灰度值/β-actin蛋白条带的灰度值表示相对蛋白含量。

1.2.5 吖啶橙-溴乙锭(AO/EB)染色法检测细胞生存 将MDA-MB-231细胞培养于灭菌的玻片上24 h。瞬时转染UHRF1-shRNA 48 h。加入吖啶橙-溴乙锭混合液染色100 mg/mL的AO以及100 mg/mL的EB融于PBS中。用荧光显微镜检测细胞形态的变化(100×)。细胞凋亡率用以下公式检测:凋亡率(%)=凋亡细胞数/细胞总数。

1.2.6 Transwell法检测侵袭能力的影响 将5×104个细胞加入无血清培养基的上室,接种前需提前铺设Matrigel胶,加入1×104个细胞于血清培养基的上室,下室均为含10%胎牛血清的培养基。24 h后取出小室,依次经甲醛固定及结晶紫染色,采用倒置显微镜计算侵袭或迁移细胞数,实验重复3次。

1.2.7 划痕实验 将乳腺癌细胞接种至6孔板中,分别转染NC组与UHRF1-shRNA组12 h后,待细胞完全贴壁,使用10 μL的枪头对两组细胞进行划痕,磷酸盐缓冲液清洗细胞并拍照观察,100倍视野下随机选择3个视野进行记录划痕宽度。24 h后再拍照观察,记录划痕宽度。

1.3 数据处理分析

用GraphPad Prism 5.0软件处理数据,计量资料采用t检验,Kruskal-wallis秩和检验或Wilcoxon秩和检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 沉默UHRF1后乳腺癌MDA-MB-231细胞活性的变化

UHRF1-shRNA与NC分别转染到MDA-MB-231细胞中作用48 h后,Western blot方法检测其敲减效率(图1A)。MTT方法检测转染UHRF1-shRNA后细胞活性的变化,分别与正常对照组以及NC组相比,UHRF1-shRNA转染组细胞活性相较于正常对照组(50.28+3.89)%以及NC组(48.36+5.80)%(P<0.05)有所降低(图1B)。通过AO/EB染色法和克隆形成实验检测MDA-MB-231增殖能力,发现与NC相比,UHRF1-shRNA组乳腺癌细胞增殖能力明显降低(P<0.05)(图1C,图1D)。

图1 沉默UHRF1后对乳腺癌MDA-MB-231细胞活性的影响Figure 1 Knockdown UHRF1 affected the viability of MDA-MB-231 cellsNote:A.MDA-MB-231 cells were transfected with UHRF1-shRNA or NC-shRNA and siRNA-depletion efficiency was examined by Western blot;B.MDA-MB-231 cells transfected with UHRF1-shRNA or NC-shRNA were cultured and cell viability was analyzed by MTT assay;C.MDA-MB-231 cells transfected with UHRF1-shRNA or NC-shRNA were subjected to AO/EB staining to detect changes in the nucleus.The orange-colored region indicated initiation of apoptosis;D.MDA-MB-231 cells transfected with UHRF1-shRNA or NC-shRNA were seeded into 6-cm dishes at a density of 800 cells/dish.Colony formation was assessed by crystal violet staining.*P<0.05 vs.control or NC group.

2.2 沉默UHRF1对Caspase-3通路的影响

本研究首先检测了线粒体凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax(图2A)、Bad与p-Bad(图2B)的表达,结果发现相对于NC组,沉默UHRF1后Bax与Bcl-2比值显著上调(P=0.0233),Bad蛋白表达相较于NC组显著上调(P=0.0451),而p-Bad蛋白相对于NC组显著下调(P=0.0315)。同时通过Caspase-3的活性检测,发现与NC组相比,转染UHRF1-shRNA后MDA-MB-231细胞Caspase-3活性显著升高(P=0.0194)(图2C),说明沉默UHRF1能够抑制MDA-MB-231细胞增殖是依赖于Caspase-3的活化。随后本研究又检测了XIAP蛋白的表达,相对于NC组,沉默UHRF1后XIAP蛋白的表达显著上调(P=0.0412)(图2D)。

图2 沉默UHRF1对于Bax,Bcl-2(A)Bad,p-Bad(B)以及Xiap(D)蛋白影响,及其对于caspase-3活性的改变Figure 2 Knockdown UHRF1 altered the expression of p-Bad,Bad,Bax,Bcl-2 and XIAP,and promoted caspase-3 activation in MDA-MB-231 cellsNote:Western blot was used to detect Bax,Bcl-2(A),p-Bad,Bad,(B)and XIAP(D)expression in MDA-MB-231 cells transfected with UHRF1-shRNA or NC-shRNA.Relative expression of Bax,Bcl-2,p-Bad,Bad and XIAP was normalized to β-actin.n=3 independent experiments for each group.(C)Activation of caspase 3 by UHRF1-shRNA or NC-shRNA.Data are averaged from five independent experiments for each group.*P<0.05 vs.NC group.

2.3 沉默UHRF1对于乳腺癌细胞MDA-MB-231侵袭能力的影响

Transwell以及Wound Healing实验检测沉默UHRF1对于细胞侵袭和迁移能力的影响,结果显示UHRF1能够明显的抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的侵袭和迁移能力,说明UHRF1参与了MDA-MB-231的侵袭和迁移过程(图3A,B)。

2.4 沉默UHRF1对于p53信号通路的影响

为进一步验证UHRF1是否通过p53信号通路影响MDA-MB-231细胞增殖及侵袭,结果发现与NC组相比,UHRF1-shRNA组中p53,p21Cip1/Waf1,p16INK4a蛋白的表达显著上调(P<0.05)(图4)。

图3 转染UHRF1-shRNA对于乳腺癌细胞MDA-MB-231侵袭能力的影响Figure 3 UHRF1 shRNA inhibited the migration of MDA-MB-231 cellsNote:MDA-MB-231 cells were transfected with UHRF1-shRNA or NC-shRNA.(A)Wound-Healing assay was performed to analyze the effect of UHRF1 on cell migration.Representative images(100×)and quantitative analyses are shown;(B)Transwell assay in the presence or absence of matrigel was performed.*P<0.05 vs. NC group.

图4 UHRF1-shRNA对于乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞凋亡通路的影响Figure 4 Knockdown UHRF1 increased the expression of p53,p21Cip1/Waf1 and p16INK4a in MDA-MB-231 cellsNote:A.p53 protein level;B.p21Cip1/Waf1 protein level;C.p16INK4a protein level.*P<0.05 vs.NC group.

3 讨论

UHRF1基因是近些年深受广大学者关注的一个凋亡相关基因[11]。目前,很多研究表明,其广泛参与各种生物学过程,包括表观遗传调控[12]、细胞周期调控和细胞分化调控等众多生命活动,成为遗传学研究热点。现有的文献报道,UHRF1对于肝癌[13]和胃癌[14]的发生发展有着巨大的影响。但是其对于乳腺癌增殖、侵袭的影响并没有太多的相关报道,本研究主要通过沉默UHRF1来研究其对乳腺癌细胞系MDA-MB-231增殖的作用及其相关机制。

过度增殖是恶性肿瘤发生发展的重要环节[15]。本结果显示,沉默UHRF1后,MDA-MB-231细胞的生存率均低于正常水平,表明沉默UHRF1能够抑制乳腺癌细胞的增殖,克隆形成以及AO/EB的结果均印证了UHRF1能够影响乳腺癌细胞系MDA-MB-231的活性。现有的文献[16]大多关于过表达UHRF1后对于增殖能力影响的研究,但是对于乳腺癌的研究鲜有报道。此外,本研究进一步发现沉默UHRF1基因后,MDA-MB-231细胞的增殖能力明显降低,表明UHRF1对调节乳腺癌细胞的增殖过程起到一定作用。

迁移和侵袭是肿瘤发生发展过程中重要的环节[17]。肿瘤细胞的迁移和侵袭能力与乳腺癌的预后密切相关,也是导致治疗失败的主要原因。本研究采用Transwell和WoundHealing实验检测发现沉默UHRF1后,MDA-MB-231细胞的侵袭迁移能力受抑制,表明UHRF1与乳腺癌细胞的恶性生物学行为有关。

p53基因突变被认为是目前所有人体肿瘤中最常见的基因改变。p53基因定位于染色体17p13.1,对细胞周期DNA的修复、合成、细胞分化、基因组的稳定和细胞的凋亡起调控作用,p53通过对多种基因的调控引起G1、S和G2期停顿从而调控凋亡。Huang等[18]证明p53能够参与到乳腺癌细胞凋亡的过程。Cao等[19]的研究同时证明了p53能够参与到乳腺癌的侵袭。而本研究结果表明沉默UHRF1后能够使p53蛋白表达上调,同时p53信号通路中重要蛋白p21Cip1/Waf1和p16INK4a蛋白表达也上调。

综上所述,沉默UHRF1后,能够抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖,同时也能够抑制其侵袭的能力。而这种抑制增殖和侵袭的能力可能是通过上调Caspase-3活性,进而上调p53蛋白表达,然后激活下游的p21Cip1/Waf1和p16INK4a蛋白而实现的,以上研究为UHRF1对于乳腺癌的治疗提供了理论依据。

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EffectofsilencingUHRF1onproliferationandmetastasisofbreastcancercells

CHENZhuo,KONGYiran

Harbin Medical University Cancer Hospital,Harbin 150081,China

ObjectiveThe objective of this study was to investigate the effect of UHRF1 on the proliferation and metastasis of breast cancer MDA-MB-231 cells and its mechanism.MethodsThe effect of silencing UHRF1 gene on the viability of MDA-MB-231 cells was detected by MTT assay.Colony formation assay was performed to analyze the effect of silencing UHRF1 on cell survival of MDA-MB-231 cells.The effect of silencing UHRF1 on the apoptosis of MDA-MB-231 cells was detected by acridine orange-ethidium bromide (AO / EB).Caspase-3 activity kit was used to detect the expression of caspase-3 in MDA-MB-231 cells.The expressions of Bcl-2,Bax,Bad,p-Bad,XIAP,p53,p21Cip1/Wafand p16INK4awere detectedby Western blot.The abilities of invasion and migration of MDA-MB-231 cells silenced by UHRF1were examined by Transwell and Wound healing assays,respectively.ResultsSilencing UHRF1 significantlydecreased the viability of MDA-MB-231 cells.Silencing UHRF1 decreased colony formation in MDA-MB-231 cells.Depletion of UHRF1 resulted in apoptosis inducedin MDA-MB-231 cells,showing nuclear morphological changes by AO/EB staining and increasing caspase-3 activity.After knockdown of UHRF1,the expression of Bad,XIAP,Bax,p53,p21Cip1/Waf1and p16INK4awas up-regulatedand down-regulated the expression of p-Bad and Bcl-2 in MDA-MB-231 cells.Transwell and wound healing assays demonstrated that silencing UHRF1 could decrease metastasisin MDA-MB-231 cells.ConclusionSilencing UHRF1 can inhibit the viability and survival of MDA-MB-231 cells,and inhibit the invasion and migration of MDA-MB-231 cells regulated by p53/p21Cip1/Waf1/p16INK4asignalings.

UHRF1;Breast cancer;p53;Metastasis;Apoptosis

哈尔滨医科大学附属肿瘤医院(哈尔滨 150081)

陈琢,女,(1987-),硕士,住院医师,从事外科疾病的研究。

陈琢,E-mail:zhuochen930@hotmail.com

R737.9

A

10.11904/j.issn.1002-3070.2017.06.006

(收稿:2017-07-14)

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