Aurora-A在宫颈癌及癌前病变中的表达以及与HPV感染的相关性研究

雷 蕾 叶庆华 王国增 黄贤莉 吴乾渝

Aurora-A在宫颈癌及癌前病变中的表达以及与HPV感染的相关性研究

雷 蕾1叶庆华1王国增1黄贤莉1吴乾渝2

目的分析正常宫颈、不同级别宫颈上皮内瘤变(Cervical intraepithelial neoplasia，CIN)和宫颈鳞状细胞癌(Cervical squamous cell carcinoma，SCC)组织中Aurora-A的表达差异，观察其异常表达对宫颈癌变过程的影响及与人乳头瘤病毒(Human papilloma virus，HPV)感染的相关性，了解Aroura-A在CIN与宫颈癌发病机制中的作用。方法选取已进行宫颈管分泌物高危型HPV检测的宫颈活检或手术标本存档蜡块100例，其中正常宫颈组织20例，CIN1级组织20例、CIN 2级组织20例、CIN 3级组织20例，宫颈癌全部选取的是宫颈鳞状细胞癌组织20例。采用免疫组化方法检测Aurora-A蛋白的表达水平，并分析Aurora-A表达与HR-HPV感染的相关性。结果Aurora-A在CIN以及宫颈癌中存在高表达(P<0.05)，且其阳性表达率随着宫颈病变程度的加深而增强，两者呈正相关性(r=0.475，P<0.001)；在高级别宫颈上皮内瘤变(CIN2、3)组织中，Aurora-A表达与HPV感染间存在正相关(V=0.591，P<0.05)。结论Aurora-A的异常表达可能与宫颈癌的发生发展密切有关，Aurora-A可能作为早期诊断CIN或宫颈癌的重要分子生物学指标，同时也可能是宫颈癌的潜在治疗靶点。

Aurora-A；中心体；人乳头瘤病毒；宫颈上皮内瘤变；宫颈癌

宫颈癌(Cervical cancer)是妇科常见的原发性恶性肿瘤之一[1]，根据《2016年中国恶性肿瘤发病和死亡分析》报告统计，宫颈癌居我国女性恶性肿瘤发病率前五位，严重影响广大女性的身心健康[2]。研究表明，宫颈上皮内瘤变反映了宫颈癌发生发展的连续过程，是与宫颈浸润癌密切相关的一组癌前病变。从宫颈上皮内瘤变发展到宫颈浸润癌是一个漫长但是可逆转的过程，多种因素在这个过程中起作用，众多研究一致认为，高危型人乳头瘤病毒的持续感染与CIN和宫颈癌的发生密切相关。随着对肿瘤分子生物学研究的加深，中心体在肿瘤发生发展早期阶段的作用受到广泛关注，中心体缺陷可能通过染色体不稳定性在宫颈癌形成的最早期阶段发挥作用。Aurora-A蛋白激酶是一种中心体相关蛋白，其基因扩增和高表达会引起中心体复制扩增以及功能异常，进而使细胞恶性转化而最终导致肿瘤的形成[3-4]。Aurora-A在多种肿瘤中存在过表达，与肿瘤病理、临床分期及预后紧密相关，被认为是一个新的癌基因[5]。但在宫颈癌特别是癌前病变中Aroura-A的表达还没有广泛和深入的研究[6]。本研究拟选取人正常宫颈、不同级别CIN和宫颈鳞癌组织，检测各组中Aurora-A的表达差异，分析Aurora-A的异常表达与HPV感染的相关性，明确Aurora-A是否是HPV的作用位点，从而为宫颈癌的早期诊断和预防提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

随机选取东方医院妇产科2008年11月—2012年5月已进行宫颈管分泌物高危型HPV检测的宫颈活检或手术切除标本存档蜡块100例。所有患者年龄在30～55岁之间，性生活3年以上，有完整随访资料。高危型HPV DNA检测应用杂交捕获二代技术：高危型HPV(+)宫颈病变59例，高危型HPV(-)宫颈病变41例。宫颈癌组织学类型按WHO标准选取宫颈鳞癌共20例，CIN1、2、3级各20例。所有宫颈癌患者术前均未行化疗、放疗或激素治疗；无合并其他疾病；无生殖道系统炎症；排除同时合并子宫内膜病变者。

正常宫颈组织20例，选自因子宫肌瘤入院行全子宫切除术的标本，所有子宫切除的患者均行宫颈液基细胞学检查排除宫颈疾病。以上所有组织标本的获取和使用均经过上海市东方医院伦理委员会的审核通过，并经过患者或患者家属签署知情同意书。

1.2 实验方法

使用免疫组化二步法检测组织标本中Aurora-A的表达水平。

1.3 结果判断

由两位病理科医生，在双盲条件下判断免疫组化结果，出现结果不一致时，共同讨论决定。

Aurora-A结果的判断：在光学显微镜下观察组织标本的着色程度。Aurora-A蛋白阳性表达主要表现为细胞浆以及细胞核内呈现棕黄色或者棕褐色颗粒，高倍镜下(放大200倍)随机取4个不同的视野，计算阳性细胞占比，阳性细胞率≤25%为1分，>25%且≤50%为2分，>50%且≤75%为3分，>75%为4分；同时根据染色程度计分，不染色1分，弱染色2分，中等强度染色3分，强染色4分；根据两者的乘积判断结果：≤4分为(-)；>4且≤8为(+)；>8且≤12为(++)；>12且≤16为(+++)。统计分析时(-)和(+)合为阴性或弱阳性表达，(++)和(+++)合为强阳性表达。

1.4 统计学分析

采用 SPSS 17.0统计软件进行统计分析，计数资料采用卡方检验及Fisher精确概率分析，相关性分析用等级变量的Spearman秩相关分析和分类变量的卡方检验进行列联分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Aurora-A在CIN以及宫颈癌组织中的表达

在宫颈鳞癌组织中，Aurora-A表达定位于宫颈癌细胞的胞浆及胞核，表达较强，呈棕黄色，阳性细胞较多；在CIN组织中，Aurora-A表达以胞浆着色为主，表达强度中等(图1)。在正常宫颈组织中Aurora-A几乎不表达，只有1例呈弱阳性表达。Aurora-A在正常宫颈、CIN 1、CIN 2、CIN 3、宫颈鳞癌组织中的阳性表达率依次升高。Spearman相关分析结果显示Aurora-A的表达和宫颈病变程度呈正相关关系(r=0.475，P<0.001)(表1)。进一步研究发现，在CIN组中Aurora-A存在过表达；其中高级别上皮内瘤变(CIN 2、3)中Aurora-A的阳性表达率为45%(18/40)，低级别上皮内瘤变(CIN 1)中Aurora-A的阳性表达率为15%(3/20)，两组差异有统计学意义(P=0.022)(表2)。

图1 Aurora-A在CIN1、CIN2、CIN3和宫颈鳞癌中的阳性表达Figure 1 Positive expression of Aurora-A in CIN1-3 and SCCNote：A.HE；B.IHC.

表1 Aurora-A在不同宫颈组织中的表达情况(n，%)Table 1 The expression of Aurora-A protein in different cervical tissues(n，%)

Note：1.The difference between the five groups was analyzed by Chi-square test regarded as significant difference：P<0.05；2.The correlation between Aurora-A and cervical lesions was analyzed by Spearman correlation analysis showed significant positive correlation：r：0.475，P<0.05.

表2 Aurora-A在宫颈上皮内瘤变组织中的表达情况(n，%)Table 2 The expression of Aurora-A protein in different degrees of CIN(n，%)

Note：The difference between the two groups was analyzed by Chi-square test regarded as significant difference：P=0.022，P<0.05.

2.2 HPV在CIN以及宫颈癌组织中的表达

HR-HPV在正常宫颈、CIN 1、CIN 2、CIN 3、宫颈鳞癌组织中的阳性表达率分别为20%(4/20)、35%(7/20)、60%(12/20)、80%(16/20)、100%(20/20)(图2)。五组间比较使用卡方检验，结果显示，HR-HPV在这五组间的阳性表达率差异有统计学意义(P<0.001)。HPV和宫颈病变程度的相关分析使用卡方检验求Cramer′sV系数，V=0.591，P<0.05，呈显著正相关(表3) 。

表3 HPV在不同宫颈组织中的表达Table 3 The HPV infection in different cervical tissues(n，%)

Note：1.The difference between the five groups was analyzed by Chi-square test：P<0.05，regarded as significant difference；2.The correlation between HPV and cervical lesions was analyzed by Spearman correlation analysis showed significant positive correlation：r：0.455，P<0.05.

2.3 Aurora-A表达与HPV感染的相关性

选取的标本均检测HR-HPV，结果显示HPV在正常宫颈、CIN 1、CIN 2、CIN 3、宫颈鳞癌组织中的阳性表达率分别为20%(4/20)、35%(7/20)、60%(12/20)、80%(16/20)、100%(20/20)。使用卡方检验进行列联分析，其中φ的绝对值<0.3无相关，φ的绝对值>0.3有相关，但相关较弱，φ的绝对值>0.6有相关，相关较强。在正常宫颈组织中Aurora-A和HPV的共阳性表达率为0%(0/20)，不具有相关性(φ=-0.115，P>0.05)；在CIN1中两者共阳性表达率为5.00%(1/20)，不具有相关性(φ=-0.015，P>0.05)；在CIN2、3两者共阳性表达率为40.00%(16/40)，呈正相关关系(φ=0.373，P<0.05)；宫颈鳞癌HPV阳性表达率为100 %，无法进行统计学分析(表4)。

表4 Aurora-A与HPV在不同宫颈组织中表达的比较Table 4 Comparison of Aurora-A and HPV infection in different cervical tissues(n，%)

3 讨论

流行病学和基础研究已经明确高危型人乳头瘤病毒(Human papilloma virus，HPV)的持续感染是宫颈癌前病变以及宫颈癌的关键因素。近年来，众多学者在分子生物学领域对肿瘤发生机制进行深入研究，发现中心体相关蛋白的异常表达导致上皮细胞中心体复制异常以及分离缺陷，在有丝分裂期使染色体错误分离以及分配不平衡，导致染色体不稳定以及非整倍体形成，是肿瘤发生的早期事件[8]。作为一个定位于中心体上的蛋白激酶，Aurora-A与中心体密切相关，在本实验中，我们发现Aurora-A的阳性表达率随着CIN的发展逐渐升高，宫颈癌中阳性表达率最高，我们推测随着CIN级别的进展，中心体异常情况加深。吕玉宇等[9]研究发现Caski细胞的中心体微管蛋白表达水平明显高于H8细胞，说明中心体扩增是宫颈癌的重要特征之一。同时，高危HPV感染可能引起中心体异常，在宫颈癌前病变中甚至可以出现病理性核分裂。Skyldberg等[10]发现在高危HPV感染的宫颈病变中，随着宫颈上皮内瘤变的发展，中心体数目逐渐增加，宫颈癌中心体数目明显高于CIN。Duensing等[11]研究发现，同时表达HPVE6、E7癌基因的宫颈细胞中出现中心体数目异常，影响双极纺锤体的形成，从而导致染色体非整倍体以及基因组不稳定。所以我们推测Aurora-A的过表达通过导致中心体异常引起染色体不稳定，从而导致基因组不稳定，可能是其介导宫颈癌发生与发展的重要机制之一。

在本课题中，我们发现Aurora-A在正常宫颈、不同级别CIN、宫颈鳞癌组织中的阳性表达率依次升高，在CIN2、3组织中Aurora-A和HPV共阳性表达率呈正相关关系，提示Aurora-A可能在CIN到宫颈癌的进展过程中起到一定作用。我们推测Aurora-A可能通过以下途径促进宫颈癌发生：(1)Aurora-A参与p53细胞调控通路，使抑癌基因p53失活，导致肿瘤发生[12]。在宫颈癌的发生过程中，HPV E6可通过形成E6-AP复合物的介导，促使p53进入泛素依赖的降解途径[13]。而Aurora-A可以直接磷酸化p53的ser315位点，促进Mdm2与p53结合，并通过泛素化途径降解p53蛋白[14]，进一步实验发现，抑制Aurora-A的表达可以减少p53的315位丝氨酸的磷酸化，增强其稳定性，使细胞周期阻止在G2/M期。Aurora-A还可以磷酸化p53的ser215位，下调其下游靶基因的表达，从而使p53失活，细胞逃离正常凋亡，处于无限增殖[15]；(2)Aurora-A通过上调c-myc表达，诱导端粒酶活性参与转化细胞。研究证实端粒酶的激活与宫颈异型增生和宫颈癌的进展过程相关。原癌基因c-myc编码的蛋白可直接结合到多种细胞hTERT基因的核心启动子5′端的E-box上，调节hTERTmRNA的表达，激活端粒酶，诱导细胞转化和肿瘤形成[16]。体外实验已证实Aurora-A高表达在卵巢癌细胞HIOSE118和乳腺癌细胞株MCF-710A中上调c-myc，诱导端粒酶活性[17]。Yang等[18]亦在研究发现，Aurora-A的高表达不仅可以诱导c-myc蛋白表达升高，增加其转录活性，并且可促进中心体扩增的能力。说明Aurora-A在宫颈细胞的恶性转化中有枢纽作用。所以我们推测Aurora-A可能主要通过以上两个方面在宫颈癌的发生发展过程中起作用。

随着肿瘤分子生物学的发展，对宫颈癌的研究已经深入到细胞分子和基因水平。在人类恶性肿瘤中广泛存在中心体异常，且都发生在肿瘤发生早期，Aurora-A是与中心体功能密切相关的一类蛋白激酶，其高表达于人类多种恶性肿瘤组织中，已经明确为一种新的癌基因。Aurora-A蛋白表达可作为早期诊断宫颈癌的重要分子生物学指标，其也是一种潜在的肿瘤治疗靶点，研发Aurora-A蛋白激酶抑制剂可能为宫颈癌的临床治疗提供助力。

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ExpressionofAurora-Aincervicalcancerandprecancerouslesions，anditscorrelationwithHPVinfection

LEILei1，YEQinghua1，WANGGuozeng1，HUANGXianli1，WUQianyu2

1.Department of Obstetrics and Gynecology，Dongfang Hospital，Tongji University，Shanghai 200123，China；2.Shanghai Municipal Health and Family Planning Commission

ObjectiveThe objectives of this study were to investigate the expression of Aurora-A protein in cervical cancer and precancerous lesions，and its relationship with human papilloma virus(HPV)infection，and to analyze the role of Aurora-A in the pathogenesis of cervical cancer.MethodsOne hundred cases of cervical biopsy or surgical resection specimens were collected from high-risk HPV(HR-HPV)test.There were 20 cases of normal cervical tissues，20 cases of CIN grade 1(CIN1)，20 cases of CIN grade 2(CIN2)，20 cases of CIN grade 3(CIN3)，and 20 cases of cervical squamous cell carcinoma.The expression of Aurora-A protein was detected by immunohistochemistry and the correlation between Aurora-A expression and HR-HPV infection was analyzed.ResultsAurora-A was highly expressed in cervical intraepithelial neoplasia and cervical cancer(P<0.05)，and its positive expression rate increased with the degree of cervical lesions.There was a positive correlation between Aurora-A expression and cervical cancer(r=0.475，P<0.001).There was a positive correlation between Aurora-A expression and HR-HPV infection in CIN2 and CIN3(V=0.591，P<0.05).ConclusionAurora-A may be associated with the development of cervical cancer.Aurora-A can be used as an important biomarker for the early diagnosis of cervical intraepithelial neoplasia or cervical cancer.It is also a potential therapeutic target for cervical cancer.

Aurora-A；Centrosome；Human papillomavirus；Cervical intraepithelial neoplasia；Cervical cancer

上海市卫生和计划生育委员会面上项目(201640246)

1.同济大学附属东方医院妇产科(上海 200123)；2.上海市卫生和计划生育委员会

雷蕾，女，(1980-)，硕士，主治医师，从事妇科肿瘤的研究。

吴乾渝，E-mail：wuqianyu369@163.com

R737.3

A

10.11904/j.issn.1002-3070.2017.06.003

(收稿：2017-05-18)