四川腌菜中氨基甲酸乙酯的安全性分析

夏于林 程铁辕 张 莹

（四川出入境检验检疫局宜宾办事处 四川宜宾 644000）

1 前言

氨基甲酸乙酯简称EC，是发酵食品和酒精饮料生产过程中的伴随产物，可自然产生于发酵食品、烘焙食品和饮料酒中，属于2A类致癌物[1，2]。鉴于其致癌性，EC是当前食品安全领域的一个研究热点，研究对象集中于发酵食品特别是葡萄酒[3]、日本清酒[4]、中国白酒[5]和黄酒[6]等酒类产品。四川腌菜是川菜的重要原料，四川四大腌菜是指涪陵榨菜、四川芽菜、四川冬菜及腌大头菜。四大腌菜中，榨菜是世界三大名腌菜之一，其余3种则被熊四智（2003）列入川料辅料八珍，并认为是四川的“珍奇、珍稀、珍贵、珍宝”[7]。广义而言，凡是利用微生物发酵作用制取所得的食品均可称为发酵食品，按此定义，四川腌菜亦属于发酵食品。

综合前人研究成果，肖泳和邓放明[8]对于EC的检测方法有一个很好的总结，现阶段对发酵食品中氨基甲酸乙酯的分析检测主要有以下几种方法：傅立叶变换红外光谱法（FTIR）[9]、气相色谱法（GC）[10]、气相色谱质谱联用法（GC/MS）[11]、高效液相色谱-荧光法（HPLC/FLD）[12]、气相色谱串联质谱法（GC/MS/MS）[13]、液相色谱串联质谱法（HPLC/MS/MS）[14]。 采用LC/MS/MS法检测发酵食品中氨基甲酸乙酯多有报道[15]，根据本实验室现有条件及前期的技术积累，本项目采用LC/MS/MS法对四川省内不同产地腌菜产品中的氨基甲酸乙酯含量进行分析研究，采用GC/MS法对氨基甲酸乙酯产生的前体物质乙醇进行扫描检测，以期对四川腌菜在EC方面的安全性进行深入了解。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 实验材料

购买四川省内不同产地及工艺的腌菜 （包括芽菜、冬菜等），同种样品购买数量为3个，并将同种3个样品混匀后使用。对于长段型样品，先将其剪成短条再粉碎后使用，对于碎米型样品，直接将其粉碎后使用，以使不同样品经处理后达到一致。具体样品产地及类型见表1。

表1 实验材料

2.1.2 试剂及耗材

氨基甲酸乙酯标准品：购自国家标准物质信息中心；18 MΩcm 超纯水；0.45 μm 水相滤膜；1 次性注射器。

2.1.3 仪器

LC/MS/MS仪：美国安捷伦6410；GC/MS/MS仪：日本岛津GCMS-TQ8040；超声清洗仪：中国昆山舒美KQ-500TDV；超纯水仪：美国密理博Milli-Q A10。

2.2 方法

2.2.1 样品处理

（1）LC/MS/MS 测定：取 10 支玻璃试管（5 mm×150 mm），按照1～9进行编号，9号样品进行加标。准确称取已粉碎样品5.000 g（精确至0.001 g）于玻璃试管中，定量加入10 mL超纯水，超声提取30 min后，将提取液经0.45 μm滤膜过滤待测。

（2）GC/MS扫描：准确称取经过处理的样品2.000 g（精确至0.001 g）于10 mL进样瓶中，按照1～9进行编号，50℃水浴4 h，顶空进样，采用GC/MS进行扫描检测，进样量为2 mL。

2.2.2 标准溶液配制

（1）氨基甲酸乙酯标样母液（1.0 mg/mL）：准确称取0.0500 g（精确到0.0001 g）氨基甲酸乙酯标准品，用甲醇定容至50 mL。

（2）氨基甲酸乙酯中间液（5.0 μg/mL）：准确吸取浓度为1.0 mg/mL的母液0.5 mL，用甲醇定容至100 mL。

2.2.3 标准工作曲线

分别准确吸取 5.0 μg/mL 中间液体 0.0 μL、10 μL、20 μL、40 μL、60 μL、80 μL 于 1.0 mL 进样小瓶中，用去离子水定容至1.0 mL，得到浓度为0.0 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、300 ng/mL、400 ng/mL的标准工作曲线溶液。

2.2.4 仪器条件

首先对LC/MS/MS仪器和GC/MS仪器进行调谐，以达到最佳检测状态，再分别对液相及质谱部分各参数进行条件优化，最终优化条件见表2（LC/MS/MS仪器参数 ）、表3（GC/MS仪器参数）。具体参数可根据实际情况调整优化。

表2LC/MS/MS仪器参数

表3 GC/MS扫描乙醇仪器参数

2.2.5 数据处理

在进行仪器条件最优化及仪器调谐后，依次对试剂空白、标准系列、样液进行测定，根据样液中氨基甲酸乙酯定量离子响应值高低，绘制出回归曲线，样液值以回归曲线进行定量计算，所得值即为样液中氨基甲酸乙酯含量。同时向每个样品中加入氨基甲酸乙酯标准溶液，其在样品中的最终浓度为100 ng/mL，测定回收率。

3 结果与分析

3.1 LC/MS/MS结果

3.1.1 样品中氨基甲酸乙酯含量

图1为氨基甲酸乙酯标准曲线，图2为定量离子图。图1中，R2=0.9997，表明数据拟合效果很好；图2中，标准物质峰型很好，无拖尾、无前沿等情况。分析结果表明：9种样品中均未检出氨基甲酸乙酯成分。

图1 LC/MS/MS法氨基甲酸乙酯标准曲线

图2 LC/MS/MS法定量离子图

3.1.2 回收率

图3为加标样品定量离子流图，表4为 LC/MS/MS方法回收率实验结果。结果显示加标回收率为89.31%～112.5%。

表4 LC/MS/MS方法回收率实验

3.1.3 精密度、检出限（LOD）、定量限（LOQ）LC/MS/MS法实验分析结果见图4。

精密度：在同一实验条件下，对氨基甲酸乙酯标样（最终浓度为100 μg/L）进行7次测定，测得其相对标准偏差RSD为3.7%。

LOD：以定量离子响应3倍信噪比得出LOD为15 μg/kg。

LOQ：以定量离子响应10倍信噪比得出LOQ为 40 μg/kg。

3.2 GC/MS结果

图5为GC/MS法样品中乙醇分析结果，发现腌菜样品中确实含有发酵产生的乙醇。

图5 GC/MS法实验scan分析结果

4 讨论

根据现有研究成果，氨基甲酸乙酯在食品发酵和贮藏过程中的形成机理不尽相同，综合来看，主要有以下几条途径：由焦碳酸二乙酯和氨反应形成氨基甲酸乙酯[16]；由氰化物和乙醇反应形成氨基甲酸乙酯[17]；由氨甲酰磷酸和乙醇反应形成氨基甲酸乙酯[17]；由尿素和乙醇反应形成氨基甲酸乙酯[16]；由瓜氨酸和乙醇反应形成氨基甲酸乙酯[18]。上述9种四川腌菜中不含有氨基甲酸乙酯，主要与四川腌菜的原料及发酵工艺有关。在腌菜发酵过程中，既存在有益微生物的发酵作用也存在有害微生物的发酵作用，其中，有益微生物的发酵作用有乳酸发酵、醋酸发酵、酒精发酵等，有害生物的发酵作用有丁酸发酵等。

采用GC/MS法对腌菜中的乙醇进行扫描分析后发现样品中确实含有乙醇，表明乙醇是四川腌菜发酵过程中的一种产物。通过上文中对氨基甲酸乙酯生成途径的分析可以看出，除了由焦碳酸二乙酯和氨反应生成氨基甲酸乙酯这一途径外，其他途径均是由不同前体物质与乙醇反应生成。因腌菜样品中检测到含有乙醇，四川腌菜中未生成氨基甲酸乙酯的原因应该是与缺少另一种前体物质或者是具有该前体物质但未达到乙醇与该前体物质反应生成氨基甲酸乙酯的条件有关，也表明了现有工艺条件下四川腌菜在氨基甲酸乙酯方面是安全的。在下一步的研究中，可以深入探究作为发酵食品的四川腌菜未生成氨基甲酸乙酯的机理，以期能够为抑制某些发酵食品生成氨基甲酸乙酯提供一些对比研究。

5 结论

本研究结果显示四川腌菜样品中不含有氨基甲酸乙酯，这与腌菜的原料及发酵工艺有关，结果证实了四川腌菜在氨基甲酸乙酯方面的安全性。

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