肠炎沙门菌环介导等温扩增快速检测方法的建立

张海艳 周赞虎 胡元庆 刘 斌

（1.漳州卫生职业学院 福建漳州 363000；2.漳州出入境检验检疫局；3.闽南师范大学生物科学与技术学院；4.西北农林科技大学）

1 前言

沙门菌是一种常见的食源性致病菌，据统计在世界上很多地方的细菌性食物中毒中，沙门菌引起的食物中毒常列首位。国家卫生计生委办公厅关于2015年全国食物中毒事件情况的通报[1]中显示：我国2015年的食品安全事件中，生物性食物中毒事件的中毒人数最多，占全年食物中毒总人数的53.7%；主要致病因子为沙门菌、副溶血性弧菌、蜡样芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌等，其中沙门菌位列第一位。

沙门菌属于革兰阴性肠道杆菌，已发现近2 000多种血清型，其中与人体疾病有关的主要血清型有肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌、猪霍乱沙门菌等。而根据Mellory[2]统计研究显示，日、美等发达国家发生的食物中毒事件中，40%～80%由禽沙门菌引起，其中主要病原为肠炎沙门菌。

环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是 Notomi等[3]建立的一种新的核酸扩增方法，该方法具有特异、高效、快速等优点，可在恒温条件下60 min内扩增目的DNA，特别适用于大量样品的快速检测和筛选。本研究旨在建立一种快速、准确检测食品中肠炎沙门菌的方法并进行实际应用，以满足食品安全对致病菌的快速检测要求。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 试剂

肠炎沙门菌 （Salmonella Enteritidis CMCC 50335）、肠炎沙门菌 （Salmonella Enteritidis ATCC 13076）、肠炎沙门菌（Salmonella Enteritidis CNF56）、肠炎沙门菌（Salmonella Enteritidis CNF73）、肠炎沙门菌（Salmonella Enteritidis CNF75）、阿博尼沙门菌（Salmonella Abony NCTC 6017）、甲型副伤寒沙门菌（Salmonella Paratyphi A CMCC 50093）、乙型副伤寒沙门菌（Salmonella Paratyphi B CMCC 50094）、丙型副伤寒沙门菌 （Salmonella Paratyphi C CMCC 50017）、浦那沙门菌（Salmonella Poona NCTC 4840）、鼠伤寒沙门菌 （Salmonella Typhimurium ATCC 14028）、塔拉哈西沙门菌 （Salmonella Tallahassee ATCC 12002）、维洛尔沙门菌 （Salmonella Vellore ATCC 15611）、鸭沙门菌（Salmonella Anatum ATCC 9270）、亚利桑那沙门菌 （Salmonella arizonae ATCC 13314）、 婴儿沙门菌 （Salmonella Infant ATCC 51741）、猪霍乱沙门菌 （Salmonella Choleraesuis ATCC 10708）、枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis ATCC 6633）、弗氏拧檬酸杆菌 （Citrobacter freundii ATCC 8090）、 阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacaekk ATCC 13047）、阪崎肠杆菌 （Enterobacter sakazakii ATCC 50205）、大肠杆菌（Escherichia coli ATCC 11246）、大肠杆菌 （Escherichia coli ATCC 25922）、单核细胞增生李斯特菌 （Listeria monocytogenes ATCC 10890）、单核细胞增生李斯特菌 （Listeria monocytogenes ATCC 15313）、普通变形杆菌（Proteus vulgaris ATCC 33425）、蜡样芽孢杆菌 （Bacillus cereus CMCCCB76330）、痢疾志贺菌 （Shigella dysenteriae CMCC 51335）、金黄色葡萄球菌 （Staphylococcus aureus ATCC6538）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC 25923）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus ATCC 33846）、 霍乱弧菌 （Vibrio cholerae ATCC 25871）共32个菌株：均购于中国工业微生物菌种保藏管理中心；

Bst DNA聚合酶大片段：NEB公司；甜菜碱：Sigma公司；dNTPs、SYBR Green I 染料：上海生工；其他试剂均为分析纯级。

2.1.2 仪器设备

TGRADIENT 96梯度PCR仪：德国Biometra公司；FIREREADER凝胶成像仪：英国UVItec公司；XMTD-204水浴锅：江苏省金坛市江南仪器厂。

2.2 方法

2.2.1 DNA模板制备

取单菌落于100 μL无菌水，100℃水浴10 min，冰浴2 min，12 000 g离心2 min，上清液即为模板DNA，-20℃保存备用。

2.2.2 引物设计与合成

将基因库里肠炎沙门菌基因组中的基因序列，利用NCBI BLAST上的软件，与其他血清型的沙门菌的基因组和非沙门菌的基因组进行比较，选择出只有肠炎沙门菌才有的基因序列，获得肠炎沙门菌特异基因SEN1393。该基因序列只存在于肠炎沙门菌中，而沙门菌的其他血清型以及非沙门菌的菌株基因组中均未发现此基因。根据SEN1393基因设计肠炎沙门菌LAMP引物（表1），引物由上海生工生物工程技术公司合成。

表1LAMP引物

2.2.3 LAMP反应体系初建

根据文献[4]，LAMP 基本反应体系为 25 μL，外引物：内引物：环引物为1∶8∶8，F3和B3各0.2 μmol/L，FIP 和 BIP 各 1.6 μmol/L，LF 和 LB 各 1.6 μmol/L，dNTP Mixture 1.6 mmol/L，ThermoPol缓冲液 1×，甜菜碱 0.8 mol/L，MgSO48 mmol/L，DNA 模板2 μL，8 U Bst DNA 聚合酶 0.5 μL， 加双蒸水至 25 μL。反应混合物先在95℃ 加热5 min使DNA解链，然后在63℃孵育60 min，最后在85℃、10 min终止反应。

2.2.4 LAMP反应体系优化

反应体系（25 μL）分别进行反应温度和引物浓度比例优化，每组反应进行3个重复。反应温度分别设为 58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃；引物浓度设置引物配比（外引物：内引物：环引物）分别为 1 ∶1 ∶1、1 ∶2 ∶2、1 ∶2 ∶4、1 ∶4 ∶2、1 ∶4 ∶4、1 ∶8 ∶2、1∶8∶4、1∶8∶8等 8组浓度比。

2.2.5 特异性实验

用5株不同的肠炎沙门菌菌株、12株常见的非肠炎沙门菌菌株和15株食品中常见的污染菌菌株进行特异性验证；提取以上各种菌株基因组DNA，用2.2.4节优化后的方法进行检测，验证该方法检测肠炎沙门菌的特异性。

2.2.6 敏感性实验

将提取的肠炎沙门菌ATCC13076菌株的DNA模板稀释10个梯度，进行检测；DNA浓度依次为9.4 ng/μL、940 pg/μL、94 pg/μL、9.4 pg/μL、940 fg/μL、94 fg/μL、9.4 fg/μL、0.94 fg/μL、0.094 fg/μL、0.0094 fg/μL和无菌ddH2O，依据2.2.4优化后的方法进行检测，确定该方法的检出限。

2.2.7 食品样品检测

将购买的液体牛乳样品分为15份，每份样品249 mL。过夜培养的肠炎沙门菌CMCC50335进行10倍梯度稀释，每个梯度取1mL，分别按照106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL、102CFU/mL、101CFU/mL以及100 CFU/mL接入牛乳样品中，每个梯度重复1次。并且将 1 mL无菌水接入1份牛乳样品中作为对照。在室温下培养12 h后，每个样品取1 mL提取DNA，并按2.2.4优化后的方法进行LAMP扩增。

3 结果

3.1 扩增体系及参数优化

按照引物对不同浓度配比进行扩增，结果（图1）显示，引物配比（外引物：内引物：环引物）为1∶8∶4时，扩增结果最好。

按照不同反应温度进行扩增，结果（图2）显示，此范围内温度对扩增的影响较小，扩增结果差异不明显，因此选择LAMP常用温度60℃作为反应温度。

图1 引物浓度对LAMP的影响

图2 反应温度对LAMP的影响

最终确定的检测体系为：LAMP反应体系（25 μL）：2×反应缓冲液 12.5 μL，8 U/μL Bst DNA 聚合酶 1 μL，10 μmol/L 外引物（F、B3）各 0.25 μL，10 μmol/L 内引物（FIP、BIP）各 2.0 μL，环引物 10 μmol/L（LF、LB）各 1.0 μL，2.5 mmol/L dNTP 2.0 μL，DNA模板 2 μL，ddH2O 1 μL。 60℃ 60 min。

3.2 特异性

以建立的LAMP体系进行特异性检测，共检测17株沙门菌和15株非沙门菌，结果见表2，只有肠炎沙门菌可以检测出阳性扩增。

表2 实验用菌株

（续表 2）

3.3 灵敏度

敏感性实验结果见图3，引物的检测灵敏度为94 fg/μL。

3.4 样品检测

图3 灵敏度检测结果

4 讨论与结论

肠炎沙门菌作为细菌性食物中毒主要致病菌受到人们的广泛关注，但目前对于肠炎沙门菌的检测标准[4]仍停留在传统的分离培养和后续的生理生化鉴定上，该方法不但操作繁琐，血清学检测也容易出现偏差，而且检测周期很长，不能满足现代社会对食品安全快速检测要求；不少研究[5-7]采用PCR技术对

图4 牛乳样品检测

以建立的LAMP体系检测15份外购液体牛乳样品，结果见图4，除了接菌量为100CFU/mL浓度的样品和对照样品没有扩增外，其余样品均检测出阳性结果。肠炎沙门菌进行快速检测研究，但其检测过程需要PCR仪等贵重仪器，且对操作人员技术水平要求较高，这样造成PCR技术难以在基层推广。而LAMP技术具有操作简便，反应速度快，设备要求低等优点，目前已在很多食源致病菌检测[8-15]中运用。

目前国内用LAMP技术检测肠炎沙门菌的报道较少，袁发浒[16]根据Agron[17]报道的lygD基因为特异性靶基因，设计优化了一套LAMP引物来鉴定肠炎沙门菌，在鼠伤寒沙门菌和霍乱伤寒沙门菌等10种不同的干扰菌中特异性地检出肠炎沙门菌；细菌培养液检出限为23.3 CFU/mL。但lygD基因在肠炎沙门菌的研究很少，国内未见其他研究者研究。本研究采用比较基因组学和生物信息学技术，获得肠炎沙门菌的特异基因SEN1393，由此基因为检测靶基因，建立的LAMP检测体系具有高特异性和灵敏度，能够快速识别肠炎沙门菌，而且操作简单便捷，弥补了传统方法的不足。

本研究采用煮沸法提取模板DNA，并用其进行LAMP扩增，结果均能检测出目的菌，在保证方法特异性的前提下能达到方便、快速的目的。用该方法对食品中常见的致病菌做特异性检验，均未出现假阳性结果，显示了良好的特异性。

5 结论

本研究建立的肠炎沙门菌LAMP检测方法，具有特异性强、灵敏度高、方便、快捷、成本低等特点，适用于食品中肠炎沙门菌的快速检测。

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