肺结核病蛋白质标志物筛选及临床价值研究

牟宝华 施力颖 尉理梁 王冲 江婷婷⋆

·临床研究·

肺结核病蛋白质标志物筛选及临床价值研究

牟宝华 施力颖 尉理梁 王冲 江婷婷⋆

目的 探讨肺结核病蛋白质标志物的筛选方法。方法 利用酶联免疫吸附法筛选肺结核病的治愈标志物。结果 α-1抗胰糜蛋白酶（AACT）、丛生蛋白（CLU）、免疫球蛋白α-1链C区（IGHA1）3个蛋白质在治愈肺结核病患者中均较未用药组显著降低，并且由这3个蛋白质构建的判定模型的敏感度达79.59%，特异度达77.36%。结论 AACT、CLU、IGHA1有可能成为治愈肺结核病的血清标志物。

肺结核病 酶联免疫吸附法 治愈 标志物

Objective To explore the scanning of tuberculosis biomarkers. Methods The enzyme-linked immunosorbent assays aimed on proteins related with the inf l ammatory state were performed. Result Alpha-1-antichymotrypsin（AACT），clusterin（CLU），and Ig alpha-1 chain C region（IGHA1）showed signif i cantly reduced levels in cured pulmonary tuberculosis（TB）patients than untreated ones. Furthermore，the decision model established by these three proteins reached a sensitivity of 79.59%，and a specif i city of 77.36%. Conclusion It is suggested that AACT，CLU，IGHA1 may be served as potential biomarkers for curing TB.

Pulmonary tuberculosis ELISA Cured Biomarkers

据WHO报道［1］，2015年全球肺结核新发病例1040万。中国第五次结核病流行病学调查［2］，＞15岁活动性肺结核患者499万，肺结核仍是中国传染性疾病的重要防治对象。肺结核的治疗一直沿用WHO的督导化疗方案［3］。痰培养是用于鉴别治疗结果最常用检查手段，但有培养时间长、分辨功效差的缺点［4］。因此亟需发现一种非培养、高效、定量的衡量治疗效果的新方法［5］。研究表明，α-1抗胰糜蛋白酶（AACT）、丛生蛋白（CLU）、免疫球蛋白α-1链C区（IGHA1）均与机体炎症状态相关，且被发现在初诊肺结核病患者中显著改变［6］。本文探讨肺结核病蛋白质标志物的筛选方法。

1 临床资料

1.1 一般资料 选择 2013年6月至2016年5月绍兴市中心医院和绍兴市立医院肺结核病患者181例，男101例，女80例；年龄21～56岁。排除肺外结核、恶性肿瘤、慢性疾病、自身免疫性疾病和HIV感染患者。抗结核治疗按照DOTS标准进行，同时采取随访制度，其中未用药63例、用药2个月57例和治愈61例，三组患者年龄、性别、体重指数等一般资料比较差异无统计学意义（见表1）。本项目经伦理委员会批准，患者均知情并签署同意书。

表1 肺结核病患者基本资料（x±s）

1.2 方法 （1）仪器与试剂：Bio-Rad Xmark微孔板分光光度计；华利达恒温恒湿箱。人AACT（试剂盒ELISA Kit， 检测 范 围 ：0.312～20mg/L，P01011）、人CLU（试剂盒 ELISA Kit，检测范围 ：3.12～200μg/L，P10909）和人IGHA1（试剂盒 ELISA Kit，检测范围：0.49～2000μg/L，P01876）购自武汉华美生物工程有限公司。（2）样本采集：所有受试者均晨起空腹抽血，取外周血5.0ml于不抗凝真空采血管中，4h内于4℃、3000r/min离心10min，取上层血清液，血清分装后保存于-80℃备用。（3）酶联免疫吸附实验（ELISA）：按说明书要求，按一定比例稀释血清样本：人AACT试剂盒血清稀释比例为1：400，人CLU试剂盒血清稀释比例为1：10000，人IGHA1试剂盒血清稀释比例为1：16000。按试剂说明书操作使用，Xmark微孔板分光光度计在450nm波长下读取吸光度，并估计蛋白浓度。1.3 统计学方法 采用SPSS16.0和GraphPad Prism 5软件。计量资料以（x±s）表示，用Mann-Whitney U检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组患者各检测指标比较 本实验共纳入未用药肺结核病患者63例，用药2个月肺结核患者57例，治愈肺结核患者61例。患者临床检查结果统计分析发现：白蛋白、球蛋白、白球比、乳酸脱氢酶、葡萄糖和免疫球蛋白A在治愈组较未用药组有显著差异（P＜0.05），且总蛋白、白蛋白、载脂蛋白A1、C反应蛋白、补体C4在用药2个月组和未用药组亦存在显著差异（P＜0.05）见表2。

表2 三组患者各检测指标比较（x±s）

2.2 ELISA结果分析 通过对三组患者血清进行3个时间点的ELISA检测，发现血清AACT、CLU、IGHA1蛋白质的表达水平差异有统计学意义（P=0.043，P=0.026，P＜0.001）， 且 存 在 线 性 趋势（P=0.015，P=0.013，P＜0.001）。 其 中，AACT、CLU、IGHA1三个蛋白质在治愈肺结核病患者中均较未用药组显著降低（分别为［（1236.66±890.80）μg/ml vs （1948.24±1484.23）μg/ml，P=0.010］；［（103.55±33.07）μg/ml vs （125.34±59.77）μg/ml，P=0.021］；［（688.73±324.07）μg/ml vs （1346.44±783.93）μg/ml，P＜0.001］。 另外，IGHA1在 用 药2个月组即显著下降［（1111.98±732.53）μg/ml vs（1346.44±783.93）μg/ml，P=0.039］（ 见图 1）。

图1 肺结核病患者用药前后血清蛋白质水平改变

2.3 逻辑回归模型的建立与分析 绘制ROC曲线，发现AACT、CLU、IGHA1三个蛋白质的曲线下面积分别为0.617、0.574和0.816。通过逻辑回归分析，用这3个蛋白质构建回归方程：Logit（p）=4.3584-0.0003916*（AACT）-0.008404*（CLU）-0.003114*（IGHA1）。该模型的灵敏性和特异性均较单一蛋白质升高，敏感度为79.59%，特异度为77.36%，曲线下面积为 0.841（见图 2）。

图2 判定肺结核病是否治愈的逻辑回归模型

3 讨论

浙江省肺结核病治愈率低下约83.2%，其中新涂阳率86.0%，低于全国平均水平（92.0%），患者疗程末期痰涂片检查与否是影响治愈率的首要因素，痰涂片检查阳性率低进一步影响患者的治愈率。因此，寻找快速、准确的肺结核病疗效评价标志物具有重要意义。

回顾性研究［7］发现，高敏C反应蛋白（hs-CRP），和降钙素原在肺结核病患者体内升高，并在抗结核治疗后显著下降。高智等［8］也发现肺结核病患者强化期治疗后IL-2、SIL-2R显著升高，IL-4显著下降。多项研究表明，抗结核治疗后肺结核病患者血清小分子水平有所改变，可以作为肺结核病治愈的指标。也有研究［9］指出肺结核病患者肝脏功能受损，白蛋白减少；免疫系统激活，球蛋白增加；补体系统激活。本资料显示，抗结核治疗后肺结核病患者向健康转归，相应临床检测指标恢复正常水平。另外，宋仕玲等研究［10］认为肺结核病患者多种血清免疫球蛋白、补体蛋白在抗结核治疗后明显好转。而本资料显示免疫球蛋白A显著改变，这可能是由于样本数更大，修正了前人研究的抽样误差。

AACT是一种急性反应期蛋白，在炎症状态下升高；同时，也是一种血清抑制因子，可抑制蛋白酶活性。有研究表明，AACT蛋白质在未用药的肺结核病患者中显著升高［6］。而在本实验中，在治愈后的肺结核病患者中，AACT含量显著下降。这表明，肺结核病患者的炎症状态在治愈后得到改善。AACT还是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂的成员，能调节中性粒细胞组织蛋白酶G的活性，中性粒细胞组织蛋白酶G是一种蛋白水解酶可导致血管基质降解和凝血障碍，肺结核病患者血液呈高凝血状态。因此，作者认为AACT蛋白可能也与患者凝血状态相关，表明治愈后患者高凝血状态恢复。

CLU（又称为载脂蛋白J），是一种75～78kDa的分泌异质二聚体的糖蛋白，其能激活小胶质细胞，引发炎症级联反应，与多种炎性疾病相关。同时，CLU蛋白是一种细胞外分子伴侣，具有可溶性先天免疫受体特性，能调节巨噬细胞吞噬作用［11］，并在细胞粘附和补体系统中起到重要作用［12］。有研究发现，CLU在肺结核病患者中显著升高［6］，而本资料结果显示，治愈的肺结核病患者血清CLU蛋白表达水平显著下降。这表明，治愈后肺结核病患者的炎症和免疫状态得以恢复。

免疫球蛋白A（IgA）是黏膜部位的最常见抗体，在抵抗病原菌入侵过程中具有重要作用，是引发促炎细胞过程的有效刺激。IgA通过其Fc受体与中性粒细胞上的IgA Fc受体（FcαRI）可促发炎症反应过程，FcαRI是IgA抗炎和促炎反应的调节剂［13］。本资料结果显示IgA在治愈肺结核病患者中下降。ELISA验证结果显示，治愈后的肺结核病患者IGHA1（IgA Fc片段）含量显著下降，且其在2个月强化期治疗结束时就已经显著低于未用药组。因此，作者推测IGHA1含量的降低可能与肺结核病患者治疗后的炎症反应恢复相关，可能具有预测抗结核治疗功效的作用。

通过逻辑回归分析将AACT、CLU、IGHA1三个蛋白质组成蛋白质模型，并获得诊断方程式，发现该模型对治愈的肺结核病具有良好的诊断价值。因此，作者认为AACT、CLU、IGHA1三个蛋白质可作为治愈肺结核病的血清标志物。

［1］ World Health Organization. Global Tuberculosis Report,2016.

［2］ 王黎霞,成诗明,陈明亭,等. 2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查报告. 中国防痨杂志,2012,34(8)：485-508.

［3］ World Health Organization. Treatment of tuberculosis - guidelines,4th ed. Geneva［DB/OL］.

［4］ Nahid P,Saukkonen J,Kenzie WRM,et al. Tuberculosis Biomarker and Surrogate Endpoint Research Roadmap. American Journal of Respiratory & Critical Care Medicine,2011,184(8)：972-979.

［5］ Phillips PP,Fielding K,Nunn AJ. An Evaluation of Culture Results during Treatment for Tuberculosis as Surrogate Endpoints for Treatment Failure and Relapse. Plos One,2013,8(5)：926-930.

［6］ Tanaka T,Sakurada S,Kano K,et al. Identification of tuberculosisassociated proteins in whole blood supernatant. Bmc Infectious Diseases,2011,11(12)：1-10.

［7］ 罗晓璐,刘泽端,苏国生,等.超敏C反应蛋白和降钙素原检测在结核病诊断中的临床价值. 慢性病学杂志,2014,15(4)：277-279.

［8］ 高智,蒋之,万轲.初治肺结核患者强化治疗前后检测IL-2、SIL-2R及IL-4的临床意义. 安徽医药,2012,16：215-216.

［9］ Wang C,Li Y Y,Li X,et al. Serum complement C4b,fibronectin,and prolidase are associated with the pathological changes of pulmonary tuberculosis. BMC Infectious Diseases,2014,31(14)：52.

［10］ 宋仕玲,朱艳,黄团新.卡介菌多糖核酸注射液对部队肺结核患者免疫球蛋白和C3、C4的影响. 武警医学,2008,19：707-709.

［11］ Cunin P, Beauvillain C, Miot C, et al. Clusterin facilitates apoptotic cell clearance and prevents apoptotic cell-induced autoimmune responses. Cell Death Dis,2016,7：e2215.

［12］ Koltai T. Clusterin： a key player in cancer chemoresistance and its inhibition. Oncotargets & Therapy,2014,7(2)：447-456.

［13］ Aleyd E, Heineke MH, Van Egmond M. The era of the immunoglobulin A Fc receptor FcαRI,its function and potential as target in disease. Immunol Rev,2015,268(1)：123-138.

国家重点基础研究发展计划（2014CB543002）；浙江省医药卫生一般研究计划（2014KYB288）

312000 浙江省绍兴市中心医院（牟宝华）

316000 浙江医院（施力颖）

312000 浙江省绍兴市立医院（尉理梁）

316000 杭州市妇女保健院（王冲）

510006 华南理工大学医学院（江婷婷）

*通信作者