低温复合丙泊酚对大鼠海马神经元凋亡蛋白表达及超微结构变化的影响*

何 亚，刘晓颖，邓庆华，郑小红，蒋红艳，苏湲淇，彭 兰

(1.重庆市渝北区人民医院麻醉科 401120；2.重庆医药高等专科学校 400030)

低温复合丙泊酚对大鼠海马神经元凋亡蛋白表达及超微结构变化的影响*

何 亚1，刘晓颖2△，邓庆华2，郑小红2，蒋红艳2，苏湲淇2，彭 兰2

(1.重庆市渝北区人民医院麻醉科 401120；2.重庆医药高等专科学校 400030)

目的观察低温复合丙泊酚对大鼠海马神经元凋亡蛋白Caspase-3、自噬相关蛋白Beclin 1 和LC3-Ⅱ及其神经元超微结构变化的影响，探讨丙泊酚对低温所致大鼠海马神经元自噬与凋亡的干预作用。方法将大鼠分为空白对照组(A组)、低温丙泊酚组(B组)和低温水合氯醛组(C组)，B、C两组低温干预30 min，各组进行心脏灌注，断头取脑，制备大鼠海马神经元组织标本，用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测Caspase-3的表达，用Western blot检测Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白的表达，透射电镜观察神经元超微结构的变化。结果3组Caspase-3、Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白的水平差异有统计学意义(P<0.05)；透射电镜结果显示B、C组大鼠海马区神经元均有不同程度的改变，尤其是C组神经细胞凋亡现象明显。结论低温状态下海马神经元仍有一定的自噬与凋亡现象，而丙泊酚则可减少这种损害，具有较好的神经元保护作用。

低温；异丙酚；海马;神经元；细胞凋亡

国内外大量研究都把低温当做一种器官保护措施，因其可通过降低机体基础代谢率，减少心脏做功，减少脑组织的耗氧量,增加细胞对缺氧的耐受力，从而保护大脑及其他基础代谢率较高的器官免受缺血缺氧的损害[1]。丙泊酚作为一种静脉全身麻醉药，已广泛应用于临床各科的手术麻醉，其脑保护作用也得到越来越多的研究证实[2]。然而却很少有研究注意到低温同时带来的不良反应，包括细胞的自噬与凋亡及在全身低温状态下丙泊酚对大脑神经细胞自噬与凋亡的干预。本研究通过建立大鼠丙泊酚和水合氯醛全身麻醉的亚低温模型，检测海马神经元Caspase-3、Beclin-1 和LC3-Ⅱ蛋白的表达及透射电镜观察神经细胞超微结构的变化，探讨丙泊酚对低温所致大鼠海马神经元自噬与凋亡的干预作用,以便使低温和丙泊酚在临床上得到更好的应用，提高疾病治愈率。

1 材料与方法

1.1材料 丙泊酚(西安力邦制药有限公司，产品批号1107292)；10%水合氯醛(青岛宇龙海藻有限公司，产品批号20141001)。一抗Caspase-3、二抗(Daro公司)，一抗Beclin-1、LC3(Abcam公司)，内参GAPDH一抗、HRP二抗(Western Biotechnology公司)；DAB显色试剂盒(Sigma公司)；玻璃匀浆器(宁波新芝DY89-1)、分光光度仪(上海欣茂UV-7504)、垂直板电泳转移装置(上海天能)、电泳仪(北京君意JY300C)、透射电子显微镜(第三军医大学生物测试分析中心)。

1.2方法

1.2.1大鼠全身低温模型制作 2个月龄SD健康雄性大鼠60只，清洁级，体质量150～200 g，由第三军医大学动物中心提供。大鼠共分为3组(n=20)，即空白对照组(A组)、低温丙泊酚麻醉组(B组)和低温水合氯醛麻醉组(C组)。其中每组15只大鼠用于测定海马神经元Caspase-3、自噬相关蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ的表达，其余5只大鼠用于观察海马神经元的超微结构。A组大鼠普通实验室喂养,不进行特殊处理，B组和C组分别用丙泊酚(150 mg/kg)和10%水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射，然后均采用冰袋使大鼠肛温在32 ℃保持30 min[3]。低温过程中用微量注射泵以16 mL·kg-1·h-1的速度腹腔注射平衡盐液，并观察大鼠生理机能状况。

A:A组；B：B组； C：C组

图1 3组海马神经元Caspase-3的表达

1.2.2免疫组织化学法检测Caspase-3蛋白的表达 各组大鼠观察24 h后分别进行水合氯醛腹腔麻醉开胸，暴露心脏经心尖将自制的灌注针插入主动脉，右心耳剪一小切口，依次用生理盐水250 mL，4 ℃ 4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液250 mL通过主动脉灌注固定。断头取脑[4]，将固定6 h后的海马组织经脱水、透明、浸蜡、包埋制作成石蜡块，将石蜡组织块进行连续冠状切片，采用免疫组织化学法检测Caspase-3。按说明书操作，DAB显色，光镜高倍镜视野连续计数200个神经元，阳性产物为棕黄色或棕褐色，背景为蓝色。用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统测定阳性细胞的平均光密度值(average optical density,AOD)，用AOD半定量Caspase-3蛋白的表达，AOD越大，表示Caspase-3表达越强。反之表达越弱。计算出3个视野的AOD的平均值，代表该组神经元的AOD值。

1.2.3蛋白免疫印迹法(Western blot)检测Beclin-1、LC3-Ⅱ的表达 取海马组织于无菌的EP管中，用Western blot及IP细胞裂解液(含1%的PMSF)浸泡，提取组织蛋白质样品，电泳转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，分别加入兔抗LC3单克隆抗体(1∶300)，兔抗Beclin-1多克隆抗体(1∶1 000),内参一抗的稀释终浓度为1∶3 000，然后4 ℃孵育过夜。洗膜后用封闭液将HRP二抗稀释(1∶5 000)，然后温育(37 ℃) 1.5 h，加ECL试剂，X射线胶片显像，扫描。应用Image J分析软件分析目的条带和内参的灰度值，以目的条带和内参条带的灰度比值对Beclin-1、LC3-Ⅱ进度半定量分析。

1.3大鼠海马神经元超微结构观察 各组随机选择5只大鼠，取小块海马组织快速用PBS冲洗组织周围的血液等污物后立刻放入2.5%的戊二醛固定液；2～3 min后修整样品为1 mm3，并放入新鲜的3%戊二醛固定液。按常规透射电镜样品制备方法漂洗、锇酸固定、漂洗、脱水、浸透、Spon812包埋，上机、拍照。

2 结 果

2.1神经元Caspase-3及自噬相关蛋白的表达 A组极少见到caspase-3阳性颗粒,与A组比较,B、C组则可见神经元细胞膜和细胞质中有棕黄色或棕褐色颗粒。C组Capase-3、Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白水平高于A、B组，B组各蛋白水平高于A组，比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图1、2，表1。

图2 3组海马神经元Western blot 结果

A:A组;B:B组;C：C组

图3 3组海马神经元超微结构变化

2.2各组大鼠海马神经元超微结构变化 A组大鼠海马神经元多为圆形，结构正常，核圆，核仁居中，细胞膜完整，各种细胞器丰富，排列整齐无水肿(图3A);B组超微结构损伤较轻，神经元可见轻度破坏，核固缩，细胞核的染色质高度凝聚、边缘化(图3B)。 C组细胞凋亡现象明显,可见细胞皱缩、核固缩、核内染色质分布欠均匀，核仁消失，细胞质浓缩,细胞核裂解，产生凋亡小体(图3C)。

表1 3组海马神经元Caspase-3、Beclin-1、LC3-Ⅱ 蛋白表达比较

a:P<0.05，b：P<0.01，与A组比较；c：P<0.05，与B组比较；*：AOD值；#：相对灰度值

3 讨 论

细胞凋亡是受各种基因调控的程序化死亡过程，而激活后的Caspase-3是细胞凋亡的特征性标志之一,为凋亡途径的最终执行者。自噬现象是一种高度保守的细胞行为[5]，在维护细胞内环境、实现细胞代谢和细胞器的更新方面起着非常重要的作用。但过度激活的自噬则可导致细胞程序性死亡，从而引起一系列疾病。因此检测凋亡蛋白Caspase-3的表达和自噬相关蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ的表达及透射电镜观察海马神经元超微结构的变化，可以探索低温下海马神经元自噬与凋亡的发生情况。

丙泊酚是短效静脉麻醉药，广泛应用于诱导麻醉和维持重症监护中患者的镇静，丙泊酚的神经保护功能在许多体内外研究模型中已得到证实[6-7]。本实验采用丙泊酚和水合氯醛作为诱导全身低温时的全身麻醉药，比较两组大鼠低温后海马神经元凋亡蛋白、自噬相关蛋白表达和神经元超微结构变化的差异，求证丙泊酚对低温所致大鼠海马神经元自噬与凋亡的干预作用。

实验中B、C两组Caspase-3和Beclin-1、LC3-Ⅱ阳性表达均高于A组，其神经元超微结构的损害也较A组重，这表明低温下海马神经元仍然存在一定的自噬与凋亡现象，这种变化有可能是低温手术产生不良反应的病理基础，还有研究发现低温对心肌缺血的改善并不明显，还可导致外周血管痉挛，增加外周血管阻力，使周围循环灌注降低[8],外周组织细胞缺血、缺氧及营养物质缺乏，这些不仅导致酸性物质增加，也可能造成自噬与凋亡的发生。故利用低温进行缺血、缺氧性脑病[9]的治疗时，其给神经细胞带来的损伤作用也不可忽视。

实验结果中，C组Caspase-3、Beclin-1、LC3-Ⅱ的表达强于B组，其神经元超微结构的损害也较B组重，透射电镜还发现C组海马神经元有明显的损害，可见凋亡小体形成。提示水合氯醛对海马神经细胞自噬与凋亡并无保护作用[10]。B组丙泊酚复合低温后海马神经元的Caspase-3、Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表达与C组相比呈下调趋势，表明自噬与凋亡程度减轻，神经元超微结构损伤也轻，较好地表现出丙泊酚对低温所致神经元自噬与凋亡的干预作用，这可能因丙泊酚减少Caspase-3、Beclin-1、LC3-Ⅱ的表达拮抗神经元凋亡所致，其机制与丙泊酚的抗自由基、抑制细胞内的钙超载[11]、抑制GABA再摄取[12]、拮抗Na+内流、抑制经典神经递质Ach和儿茶酚胺类的突触传递、拮抗内皮素等多个环节有关。当然，低温下出现的神经细胞自噬与凋亡现象是否为细胞的应激反应，还需对低温持续时间、不同的药物剂量、不同的时相对海马神经元自噬与凋亡的影响作进一步研究，以便将低温与丙泊酚合理应用于临床手术中，达到更好的脑保护效应，减少全身低温给术后带来的不良反应,增加手术的成功率。

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Effectsoflowtemperaturecompoundpropofolonexpressionandultrastructuralchangesofhippocampalneuronsapoptosisproteininrats*

HeYa1,LiuXiaoying2△,DengQinghua2,ZhengXiaohong2,JiangHongyan2,SuYuanqi2,PengLan2

(1.DepartmentofAnesthesiology,thePeople′sHospitalinYubeiDistrictofChongqingcity,Chongqing401120,China;2.ChongqingMedicalandPharmaceuticalCollege,Chongqing400030,China)

ObjectiveTo observe the effect of low temperature compound propofol on the changes of apoptosis protein Caspase-3,autophagy-related proteins Beclin-1 and LC3-Ⅱ and thier changes of hippocampal neurons.MethodsThe rats were randomly divided into blank control group (Group A),propofol group at low temperature (Group B) and chloral hydrate group at low temperature (Group C),Group B and C were treated with low temperature for 30 min.Then,each group was subjected to cardiac perfusion and decapitated brain to prepare rat hippocampal neuronal tissue samples.The expression of Caspase-3 was detected by immunohistochemistry,Beclin-1 and LC3-Ⅱ protein was detected by immunoblotting.The ultrastructural changes of neurons were observed by transmission electron microscopy.ResultsThe expression of Caspase-3,Beclin-1 and LC3-Ⅱ protein in each group were statistically significant differences(P<0.05).The results of transmission electron microscopy showed that the neurons in group B and C were changed in different degrees,especially in group C neuronal apoptosis is obvious.ConclusionAutophagy and apoptosis in existence still exist in low temperature condition,while propofol can reduce this damage and have better protective effect on neurons.

hypothermia；propofol；hippocampal;neurons；apoptosis

重庆市教委科学技术研究项目(KJ112502)。

何亚(1980-)，主治医师，本科，主要从事麻醉学研究。△

，E-mail:liuxaoying@163.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.34.006

R641

A

1671-8348(2017)34-4774-03

2017-08-04

2017-09-12)