右美托咪定缓解大鼠周围神经病理性疼痛的机制*

史艳燕， 王 勇， 舒 英， 余 聪， 彭晓红， 罗高平

华中科技大学同济医学院附属普爱医院麻醉科，武汉 430033

右美托咪定缓解大鼠周围神经病理性疼痛的机制*

史艳燕， 王 勇， 舒 英， 余 聪， 彭晓红， 罗高平△

华中科技大学同济医学院附属普爱医院麻醉科，武汉 430033

目的研究神经病理性疼痛大鼠脊髓中脑源性神经营养因子(BDNF)和核因子-κB(NF-κB)的表达变化，探讨右美托咪定(Dex)缓解大鼠周围神经病理性疼痛的机制。方法雌性SD大鼠24只，随机分为4组(n=6)：Sham+NS、Sham+Dex组、SNI+NS组和SNI+Dex组。Sham组实施假手术，SNI组建立坐骨神经分支选择性损伤模型，随后分别鞘内注射等量的生理盐水(NS)和Dex(1 μg/kg)。每组于术前1 d、术后1、3、7、14 d测定机械性痛阈(MWT)。免疫组织化学法检测脊髓BDNF和NF-κB的表达，Western blot法检测Dex处理后BDNF和NF-κB蛋白表达变化。结果从术后第3天起，SNI+NS组所有大鼠均出现了持续的机械性痛觉异常。免疫组化检测结果显示：BDNF和NF-κB散在表达于脊髓，BDNF主要表达在细胞质，而NF-κB主要表达在细胞核，以脊髓背角Ⅰ～Ⅳ层和背角深层Ⅴ～Ⅵ层表达较多，手术侧多于非手术侧。Western blot检测结果显示：在SNI+NS组中BDNF和NF-κB蛋白的表达水平分别为(1.11±0.56)、(2.31±0.46)，明显高于Sham+NS组的(0.72±0.26)和(0.01±0.06)，分别增加53%和206%；SNI+Dex组中BDNF和NF-κB蛋白的表达分别为(0.66±0.36)、(0.02±0.08)，与SNI+NS组相比明显降低(均P<0.05)。结论Dex通过降低BDNF和NF-κB表达缓解神经病理性疼痛。

神经病理性疼痛； 脑源性神经营养因子； 核因子-κB； 右美托咪定

神经病理性疼痛已成为一种难以处理的健康威胁，它对人们的生活质量有着深远的影响。神经病理性疼痛是一种常见的综合征，它可因许多疾病所诱发，如糖尿病性神经痛、神经根背痛、疱疹后神经痛、中风和脊髓损伤[1]，其特点表现为痛觉过敏、触诱发痛和自发疼痛[2-3]。外周性疼痛不仅可启动而且还可维持和调节神经病理性疼痛。目前由于神经病理性疼痛的机制尚不完全明确，因此治疗方面仍然面临困难[4]。

右美托咪定(dexmedetomidine，Dex)是一种新型高选择性α2肾上腺素受体激动剂，可对神经性疼痛发挥显著的镇痛作用[5]。吴婧如等[6]研究发现大鼠坐骨神经局部鞘内注射Dex可通过激活神经胶质细胞、抑制神经生长因子的过度表达和调节交感神经生长来缓解由慢性收缩损伤(chronic constrictive injury，CCI)引起的热过敏症。最新研究表明，脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)可调节急性炎症性疼痛，在神经病理性疼痛中发挥重要作用[7]。然而，在神经病理性疼痛中神经损伤是否会导致BDNF的表达上调以及Dex是否通过调节BDNF介导的信号通路发挥镇痛作用尚不清楚。本研究建立大鼠坐骨神经分支选择性损伤模型(SNI)并鞘内注射Dex，应用免疫组织化学和Western blot方法研究神经病理性疼痛大鼠脊髓中BDNF与核因子-κB(NF-κB)蛋白的表达变化，探讨Dex缓解大鼠周围神经病理性疼痛的机制。

1 材料与方法

1.1 鞘内注射

在有意识的大鼠L5和L6椎骨之间插入一个25 μL微型注射器的不锈钢针头，大鼠尾巴突然轻微的抖动表明针进入了蛛网膜下腔。间隔20 s以上注射Dex溶液或生理盐水，药物注射完10 s后移除针头，以确保药物保留时间[6]。

1.2 分组和模型制备

雌性SD大鼠24只，体重150～200 g，2月龄，购自华中科技大学实验动物中心。随机分为4组(n=6)，即Sham+NS组、Sham+Dex组、SNI+NS组和SNI+Dex组。Sham组：仅暴露大鼠左后腿坐骨神经即缝合切口；SNI组：于大鼠左腿后外侧暴露坐骨神经及其3个分支，保留腓肠神经，结扎和切断胫神经、腓总神经后缝合切口，建立坐骨神经分支选择性损伤模型[8-9]。两组随后行鞘内注射10 μL生理盐水和Dex(1 μg/kg体重)溶液，每天注射1次，共14 d。

1.3 机械性痛阈测定

使用动态足底触觉测量仪(Ugobasile公司，意大利)采取up-and-down的方法测定机械性痛阈值(MWT，指引起大鼠左后爪快速缩腿的最小力度，12 g和2 g力度的接触刺激分别代表痛觉异常和痛觉过敏)[10]。每隔5 min测定1次，重复3次，引起可靠缩腿反应的平均力度作为痛觉阈值。对刺激产生快速缩腿反应作为阳性反应。分别于术前1 d、术后1、3、7、14 d测定并计算MWT。

1.4 免疫组织化学法检测脊髓中BDNF和NF-κB的表达

术后14 d测痛后，4组各取大鼠3只，10%水合氯醛600 mg/kg麻醉后，4%多聚甲醛灌注大鼠，分离脊髓，截取L4～L6脊髓，经多聚甲醛后固定，蔗糖脱水后，冰冻冠状切片(30 μm)，切片置于0.01 mmol/L的PBS中，应用SP法进行免疫组化实验，分别检测BDNF和NF-κB的表达，实验操作按试剂盒说明书进行。

1.5 Western blot法检测脊髓BDNF和NF-κB的表达

术后14 d测痛后，4组各取大鼠3只，断头处死，迅速分离L4～L6脊髓，按1∶2(V/V)比例加入预冷的组织蛋白裂解液(50 mmol/L Tris·Cl，pH 7.5，250 mmol/L蔗糖，2 mmol/L EDTA，2 mmol/L EGTA，1 mmol/L PMSF，2.35 μg/μL Aprotinin，1 mmol/L DTT)于玻璃匀浆器内冰上匀浆，彻底匀浆至无明显组织块。然后将匀浆液置于4℃离心机12 500 g离心60 min，取上清。取等量的蛋白经过10%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳并转移到硝化纤维膜上，TBS洗膜、封闭，加入合适稀释度的抗BDNF、抗NF-κB以及β-actin一抗，室温孵育1～2 h或4℃过夜，加入合适稀释度的辣根过氧化物酶(HR)标记的二抗，室温孵育1 h。将曝光后的印迹结果扫描入计算机凝胶成像分析系统进行分析。以目的条带与内参β-actin条带的吸光度比值反映目标蛋白的相对表达量。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 一般行为学观察

实验期间，实验动物健康状态良好，无体重减轻、伤口或伤疤。SNI+NS组和Sham+NS组大鼠的总体健康状况没有区别。SNI+NS组大鼠在手术后都有不同程度的步态和姿势的变化，包括避免患爪负重和足外翻改变立姿。SNI+Dex组这些不正常的行为有所减少。

2.2 Dex对机械性痛觉超敏的影响

与Sham组相比，在SNI+NS组和SNI+Dex组中SNI操作引发了一种快速启动且持久的机械性痛觉超敏，MWT从术后1 d到14 d均明显下降。与SNI+NS组相比，DEX在术后1 d快速逆转SNI诱导的机械性痛觉超敏，术后3 d到14 d更明显(表1)。

表1 Dex对神经病理性疼痛大鼠机械性痛阈值的影响Table 1 The effect of Dex on mechanical allodynia in rats with neuropathic pain(g,±s，n=6)

与Sham+NS组比较，**P<0.01；与SNI+NS组比较，#P<0.05；与术前比较，△P<0.05

2.3 免疫组化法检测大鼠脊髓中BDNF和NF-κB蛋白的表达

采用免疫组化法检测SNI组同一只大鼠手术侧(左侧)和非手术侧(右侧)脊髓BDNF和NF-κB表达变化(图1)。BDNF和NF-κB的表达均在脊髓中散在分布，以脊髓背角Ⅰ～Ⅳ层和背角深层Ⅴ～Ⅵ层表达较多；手术侧多于非手术侧；在高倍显微镜下可见BDNF主要表达在细胞质，而NF-κB主要表达在细胞核。结果表明，SNI诱导了大鼠手术侧脊髓BDNF和NF-κB蛋白的表达。

A：脊髓背角非手术侧(×100)；B：脊髓背角手术侧(×100)；C：脊髓背角手术侧(×400)图1 SNI对脊髓中BDNF和NF-κB蛋白表达的影响Fig.1 The effect of SNI on BDNF and NF-κB protein expression in the spinal cord

2.4 Western blot法检测大鼠脊髓中BDNF和NF-κB蛋白的表达

Western blot法检测结果(图2)显示：SNI+NS组中BDNF和NF-κB蛋白的表达分别为(1.11±0.56)和(2.31±0.46)，明显高于Sham+NS组的(0.72±0.26)和(0.01±0.06)(均P<0.05)，升高比例为53%和206%。SNI+Dex组中BDNF和NF-κB蛋白的表达分别为(0.66±0.36)、(0.02±0.08)，与SNI+NS组相比明显降低(均P<0.05)。Sham+NS和Sham+Dex组中BDNF和NF-κB蛋白的表达差异无统计学意义。结果表明，SNI诱导了BDNF和NF-κB蛋白表达，而Dex鞘内注射治疗明显降低BDNF和NF-κB蛋白的表达。

3 讨论

慢性神经损伤模型为更好地理解和认识慢性疼痛的机制和病因提供可能，是研究神经病理性疼痛机制最常用的动物模型[11]。在本研究中，我们采用操作简单、产生疼痛个体差异性小、时间快的SNI模型[12]，结果发现SNI产生了明显的机械性痛觉超敏，表明该模型制备成功。此外，我们还发现，在14 d的治疗时间里，Dex鞘内注射减少了机械性痛觉超敏，表明了Dex的治疗功效，但是Dex缓解大鼠病理性疼痛的机制仍不清楚。

图2 Dex对手术侧脊髓中BDNF和NF-κB蛋白表达的影响Fig.2 The effect of Dex on BDNF and NF-κB protein expression in the spinal cord of the operation side

BDNF被证明是一种强大的脊髓感觉神经传导的调制器，并且在中央敏化发展中起着至关重要的作用。研究发现BDNF可以直接将神经信号传递给脊髓背角神经元，并进一步诱发动物的机械性异常反应。相反，在脊髓背角中减少BDNF的表达可能是导致机械性痛觉超敏衰减的一个因素[13]。有研究表明神经病理性疼痛时，星形胶质细胞CREB转录因子活性增强，增加了BDNF的表达，星形胶质细胞释放的BDNF可以增加神经元对钙离子的通透性，增加神经元的兴奋性，加强神经元对疼痛刺激的敏感性[14]。另有研究也表明神经元中NF-κB转录活性增强后，可以增加nNOS和COX-2等基因的表达，而正是这些基因的表达增加了神经元的兴奋性，导致了疼痛的产生[15-16]。由此可以认为星形胶质细胞释放BDNF的增加和神经元NF-κB的活性增加是导致神经病理性疼痛的重要机制。我们的研究结果显示，SNI动物模型中神经损伤诱导了BDNF和NF-κB蛋白表达，参与了其神经病理性疼痛的致痛机制。

神经损伤后脊髓α2肾上腺素受体对胆碱能介导镇痛的依赖性增加在一定程度上反映了脊髓胆碱能神经元从直接抑制到直接激活的变化，这种转变依赖于Gs蛋白和BDNF的相互作用。BDNF/Trk-B介导脊髓信号通路通过激活背角NMDA-2B受体参与了神经损伤性神经性疼痛的发展[17-18]。在本研究SNI+Dex组中，Dex治疗明显降低了BDNF和NF-κB蛋白的表达，提示针对BDNF和NF-κB的表达进行靶向治疗，如Dex坐骨神经鞘内注射，可以抑制神经损伤诱发的神经性疼痛。

综上所述，Dex通过降低星形胶质细胞BDNF和神经元NF-κB途径的活性缓解神经病理性疼痛，阐明了Dex参与神经病理性疼痛的机制，为神经病理性疼痛提供了有效的治疗手段。

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TheMechanismofDexmedetomidineRelievingNeuropathicPainofPeripheralNerveintheRats

Shi Yanyan，Wang Yong，Shu Yingetal

DepartmentofAnesthesiology，WuhanPu’aiHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430033，China

ObjectiveTo investigate the mechanism of dexmedetomidine(Dex) relieving neurologic pain by studying the changes of brain-derived neurotrophic factor(BDNF) and NF-κB in the spinal cord of the neurologic pain rats.MethodsTotally，24 female SD rats were randomly divided into four groups，including Sham+NS group，Sham+Dex group，SNI+NS group，and SNI+Dex group(n=6 each group).Sham group suffered from no nerve damage.In SNI groups，surgery was performed for SNI neuropathic pain model.Mechanical withdrawal threshold was measured by an automated dynamic plantar aesthesiometer.The expression levels of BDNF and NF-κB in the spinal cord of rats were detected by immunohistochemistry.The effect of Dex treatment on protein expression of BDNF and NF-κB was analyzed by Western blotting.ResultsSince the day 3 after operation，all rats in group SNI+NS developed a relative unchangeable mechanical allodynia.Immunohistochemistry results showed that the expression of BDNF was located mainly in cytoplasm in astrocyte and NF-κB in neuron according to morphologic observation.The expression levels of BDNF and NF-κB in the operation side were higher than those in the non-operation side.Western blot analysis indicated that the expression levels of BDNF(1.11±0.56)and NF-κB(2.31±0.46)in SNI+NS group were increased significantly as compared with Sham+NS group(0.72±0.26)and(0.01±0.06)by the ratio of 53% and 206% and then the expression levels of BDNF(0.66±0.36)and NF-κB(0.02±0.08)in SNI+Dex group were decreased significantly as compared with SNI+NS group(1.11±0.56)and(2.31±0.46)(P<0.05).ConclusionDex attenuates neuropathic pain in SNI model by suppressing BDNF expression in astrocytes and NF-κB activity in neurons.

neuropathic pain； brain-derived neurotrophic factor； NF-κB； dexmedetomidine

*湖北省卫生计生委科研基金资助项目(No.WJ2015MB153)；武汉市卫生计生委科研基金资助项目(No.WX15C25)

史艳燕，女，1974年生，医学硕士，副主任医师，E-mail：395200954@qq.com

△通讯作者，Corresponding author，E-mail：gaopingl@gmail.com

R745

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.06.010

(2017-06-13 收稿)