TRPC3在海人酸诱导的癫痫发作大鼠大脑皮质中表达上调

卢 敏， 何 青， 祝晓莹

河南科技大学医学院 1人体解剖与组织胚胎学教研室 3病原学教研室，洛阳 471023 2武汉六七二中西医结合医院针灸康复科，武汉 430071

TRPC3在海人酸诱导的癫痫发作大鼠大脑皮质中表达上调

卢 敏1， 何 青2， 祝晓莹3

河南科技大学医学院1人体解剖与组织胚胎学教研室3病原学教研室，洛阳 4710232武汉六七二中西医结合医院针灸康复科，武汉 430071

目的研究瞬时受体电位通道蛋白3(transient receptor potential canonical 3，TRPC3)在海人酸(kainic acid，KA)致痫大鼠大脑皮质中的表达变化，探讨其与癫痫发病的关系及意义。方法选取54只成年雄性SD大鼠随机分为对照组(NS组)18只和实验组(KA组)36只，实验组给予侧脑室注射KA 2 μg/kg(7 μL左右)制作KA致痫模型，对照组给予侧脑室注射等量生理盐水，观察记录大鼠癫痫发作的行为学表现。于癫痫发作后不同时间点(48 h、72 h)各取18只大鼠注射侧皮层脑组织，对照组于注射结束后48 h取18只大鼠同侧皮层脑组织，用半定量RT-PCR、Western blot和免疫组织化学技术(均各6只)检测TRPC3的mRNA和蛋白的含量。结果对照组大鼠无癫痫发作，实验组大鼠于注射后5 min左右出现典型痫性发作，达Ⅳ～Ⅴ级，持续数小时；实验组TRPC3的mRNA和蛋白表达水平在注射后48 h和72 h均较对照组显著增高(P<0.05)，但实验组两个时间点之间差异无统计学意义。结论TRPC3在致痫大鼠大脑皮质中的表达增加，其可能参与了癫痫的形成和发展。

癫痫； TRPC3； 海人酸； 大脑皮质

癫痫是神经系统的一种常见病，其发病机制十分复杂，还不完全清楚，目前缺乏有效的治疗手段。一般认为，癫痫发作与中枢神经系统内神经元的过度放电有关。已有的研究表明，癫痫患者脑内神经元Ca2+快速内流与细胞去极化有关，去极化到达一定程度时触发Na+内流，进而引发一系列迅速的去极化过程[1]，导致兴奋性神经递质过度释放而处于优势，兴奋性和抑制性两大系统失去平衡。瞬时受体电位通道(transient receptor potential canonical，TRPC)是广泛存在于人体各组织细胞中的一大类蛋白分子，在人体中表达其中6种，即TRPC1、TRPC3、TRPC4、TRPC5、TRPC6、TRPC7，它们形成同源或异源聚合体，作为一种非选择性阳离子通道，介导Ca2+及其它阳离子穿过细胞膜，在细胞的去极化过程中发挥作用。其中TRPC3的结构是目前研究得最清楚的，有研究显示TRPC3在结节硬化症癫痫患者皮层灶区表达升高显著[2]；TRPC3在颞叶癫痫苔藓纤维突触的再生过程中表达上调[3]；TRPC3的激活导致癫痫持续状态大鼠大脑皮层血管性水肿[4]。但这方面的基础研究还不多。海人酸(kainic acid，KA)是兴奋性氨基酸L-谷氨酸的类似物，作为一种经典致痫剂，常被用于实验动物癫痫模型的制备。因此本实验通过建立KA大鼠癫痫模型，研究TRPC3分子在癫痫大鼠大脑皮质中的表达变化，探讨TRPC3与癫痫的相互关系，进一步探索癫痫发病机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂

选取清洁级健康雄性SD大鼠54只，体重范围在180～220 g(由华中科技大学实验动物中心提供)。随机分成对照组18只和实验组36只。主要实验试剂：KA(美国Cayman公司)，兔抗TRPC3多克隆抗体(美国Abcam公司)，兔抗β-肌动蛋白(β-actin)多克隆抗体IgG(Sigma公司)，Trizol总RNA抽提试剂(Invitrogen公司)，RT-PCR试剂盒(Fermentas公司)，羊抗兔IgG二抗(北京中杉公司)。

1.2 KA大鼠癫痫模型的制备及行为学记录

大鼠经3.5%水合氯醛溶液(10 mL/kg)腹腔麻醉后固定于立体定位仪(江湾Ⅱ型)上，于前囟后0.8 mm，中线右1.5 mm处钻开颅骨，注射点在此处硬膜下3.8 mm，采用微量注射器缓慢注射药物。实验组大鼠于侧脑室注射KA 2 μg/kg(约7 μL)，对照组大鼠侧脑室注射等量生理盐水。注射完成后，保留注射针于侧脑室内5 min，然后缓慢拔针。记录各组大鼠行为学表现，参考Racine法[5]分6级(0级：无癫痫发作的行为改变；Ⅰ级：动物有胡须抖动，咀嚼动作；Ⅱ级：有头面部间歇性抽搐；Ⅲ级：动物的单个肢体节律性抽搐或阵挛；Ⅳ级：四肢均有节律性、持续性抽搐；Ⅴ级：全身性、强直性抽搐，并同时有竖尾或翻滚动作)。

1.3 半定量RT-PCR检测各组大鼠大脑皮质TRPC3 mRNA含量

TRPC3上游引物为5′-GCGGAATTCAGATGGAGGGAAGCCCATCC-3′，下游引物为5′-GCGGTCGACAGTTCACATCTCAGCATGCTG-3′，β-actin上游引物为5′-ACGGTCAGGTCATCACTA-TCG-3′，下游引物为5′-GGCATAGAGGTCTTT-ACGGATG-3′。实验组于癫痫发作后48、72 h各取6只大鼠的注射侧皮层脑组织，对照组于注射后48 h取6只大鼠的同侧皮层脑组织，Trizol法提取组织总RNA，70℃ 5 min变性后进行逆转录，条件是37℃15 min，85℃5 s，-20℃保存。获取的cDNA进行PCR扩增，TRPC3反应条件设置是95℃ 20 s，53℃ 30 s，72℃ 20 s，30个循环。以β-actin作为内参，反应条件设置是95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，30个循环。产物均在72℃延伸10 min，加EB染色后于0.2%琼脂糖凝胶中电泳，条带经凝胶扫描仪处理计算吸光度值，以TRPC3与内参β-actin的比值作为其相对表达量。

1.4 Western blot检测各组大鼠大脑皮质TRPC3蛋白表达情况

实验组大鼠于癫痫发作后48、72 h各取6只，对照组于注射后48 h取6只断头取注射侧大脑皮质，提取总蛋白，BCA法检测蛋白质浓度并标准化，以β-actin蛋白作为内参。样品彻底变性后经SDS-PAGE电泳，转至硝酸纤维素膜，转膜结束后TBST溶液洗膜3次，然后用5%脱脂牛奶4℃封闭过夜。分别加入兔抗TRPC3多克隆抗体(1∶2 000)，兔抗β-actin多克隆抗体(1∶500)孵育纤维膜(4℃过夜)。TBST溶液洗膜3次，加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(1∶5 000)室温孵育膜1 h，TBST溶液洗膜3次，ECL化学发光法显影，曝光洗片后扫描，采用Image J软件测定灰度值，以TRPC3与内参β-actin的比值作为其相对表达量。

1.5 免疫组织化学法检测各组大鼠大脑皮质TRPC3蛋白表达

实验组大鼠于相应时间点(癫痫发作后48、72 h)从左心室灌流，分别取6只大鼠注射侧大脑皮质部位的脑组织块，6只对照组大鼠于注射48 h后灌注取材，于4%多聚甲醛的磷酸盐缓冲液中后固定过夜，20%蔗糖浸泡至组织块下沉，使用冰冻切片机切片(片厚20 μm)，贴片，风干，0.01 mmol/L PBS洗片，Triton X-100(0.2%)处理30 min，0.01 mmol/L PBS洗片，3%小牛血清37℃孵育30 min。此后各片滴加兔抗TRPC3多克隆抗体(1∶2 000)孵育48 h，再滴加羊抗兔IgG二抗(1∶5 000)室温孵育膜1 h，DAB显色。脱水，透明，封片，显微镜观察并摄片。采用Image-Pro plus 6.0软件对图片进行吸光度测定，取平均值。

1.6 统计学分析

采用SPSS 12.0统计软件进行数据分析，两组间及实验组两时间点间均数比较采用两独立样本t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠行为学观察结果

对照组大鼠无癫痫发作，KA致痫实验组大鼠于注射后5 min左右出现痫性发作，达Ⅳ～Ⅴ级，表现为四肢节律性、持续性抽搐，或全身性、强直性抽搐，并同时有竖尾或翻滚动作，持续数小时。

2.2 TRPC3 mRNA水平在癫痫大鼠大脑皮质中升高

为了显示癫痫大鼠大脑皮质中的TRPC3 mRNA水平，我们使用RT-PCR法进行检测。结果显示：在碱基数2 500 bp左右的条带处(TRPC3碱基数为2 547)，实验组大鼠大脑皮质在造模后48、72 h TRPC3 mRNA水平明显高于对照组(P<0.05)，而实验组48 h和72 h两时间点之间的差异无统计学意义。见图1。

与对照组比较，#P<0.05图1 RT-PCR法检测癫痫大鼠大脑皮质TRPC3 mRNA表达水平Fig.1 TRPC3 mRNA expression in cerebral cortex of epilepsy rat detected by RT-PCR

2.3 TRPC3蛋白质表达水平在癫痫大鼠大脑皮质中上调

为了显示TRPC3蛋白在癫痫大鼠大脑皮质中

的表达水平，我们使用Western blot法进行检测。结果显示：在分子量接近100 kD处的条带(TRPC3分子量为97 kD)，实验组大鼠在造模后48、72 h的TRPC3蛋白水平与对照组比较显著增高，差异具有统计学意义(P<0.05)，实验组48 h和72 h之间的差异无统计学意义。见图2。

与对照组比较，#P<0.05图2 Western blot法检测癫痫大鼠大脑皮质TRPC3蛋白水平Fig.2 TRPC3 protein level in cerebral cortex of epilepsy rat detected by Western blotting

2.4 TRPC3在癫痫大鼠大脑皮质组织中表达增多

为了直观显示TRPC3在癫痫大鼠大脑皮质中的表达，我们采用免疫组织化学法进行检测。结果显示：对照组大鼠大脑皮质内有TRPC3阳性表达，但染色较弱(0.372 9±0.015 7)，实验组大鼠在癫痫发作后48、72 h时间点大脑皮质内TRPC3免疫染色明显增加，与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05)，而实验组48 h和72 h之间免疫染色强度[(0.756 2±0.012 9)vs.(0.864 5±0.035 8)]差异无统计学意义。见图3。

A：对照组；B：实验组癫痫发作后48 h；C：实验组癫痫发作后72 h图3 免疫组化法检测癫痫大鼠大脑皮质TRPC3的表达(DAB显色，×40)Fig.3 TRPC3 expression in cerebral cortex of epilepsy rat detected by immunohistochemistry (DAB staining，×40)

3 讨论

癫痫是一种神经系统常见病，发病机制尚不清楚。有学者认为，癫痫的发病与神经-免疫-内分泌网络调节失衡密切相关，以神经机制为主，免疫和内分泌分别在受体、信使和基因水平对其进行调节[6]。目前较一致的观点是，癫痫发病是因为中枢神经系统兴奋性与抑制性失去平衡所致，这种失衡主要与离子通道的异常改变有关。目前认为，人类特发性癫痫是一种“离子通道病”，即因有缺陷的基因编码有缺陷的离子通道蛋白而发病，如钙离子通道与癫痫相关性的研究较为明确[7]。Badea等[1]用Ca2+成像的方法观察了神经元参与癫痫发作的情况，证实Ca2+快速内流和细胞去极化有关。当去极化达到一定程度时就触发Na+内流，从而引发一系列迅速的去极化过程，进而促使细胞病理过程的发生。

TRPC在1996年被发现[8]，包括7个亚型(TRPC1-7)，其中TRPC2在人细胞中不表达。大量研究表明，TRPC主要参与形成受体门控或第二信使激活的Ca2+可透过的非选择性阳离子通道[9-10]。TRPC通道广泛存在于各组织各类细胞中，在细胞生理病理过程中发挥作用，在神经系统中的作用表现在多方面。TRPC通道与神经元的生长、增殖与分化相关[11-12]。在调节神经内分泌、长时程增强，以及突触可塑性的过程中也发挥作用[13]。在一些神经性疾病，如帕金森病(Parkinson’s disease，PD)，阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)等的发病过程中，TRPC的作用不容忽略[14-15]。TRPC通道与癫痫的相关性研究目前尚不多见。已有文献报道，TRPC4基因与癫痫大发作有明显相关性[16]；TRPC1/TRPC4异构体形成的通道在癫痫发作及其导致的神经退行性变的过程中发挥关键性作用[17]；TRPC5通道在胞膜上的插入促使海马CA1区锥体细胞的胆碱能平台电位的形成[18]；TRPC7在癫痫发作过程中发挥关键性作用[19]。而结构最为清楚的TRPC3与神经系统亦关系密切。在大鼠和人，TRPC3在中枢神经系统各部位中均有广泛表达。脑源性神经营养因子(brain derived neuotrophic factor，BDNF)对于神经的作用大多是通过TRPC3来介导的。TRPC3参与了浦肯野细胞功能和GABA能神经元的活化以及运动调节。此外，TRPC3在生长锥的引导调控方面发挥作用[20]。TRPC3与癫痫的关系报道不多见，仅见在结节硬化症癫痫[2]和难治性颞叶癫痫患者[21]脑组织标本中显示表达上调，近来一些新的研究表明，TRPC3在颞叶癫痫苔藓纤维突触的再生过程中表达上调[3]；TRPC3的激活导致癫痫持续状态大鼠大脑皮层血管性水肿[4]。

本研究选取TRPC3作为研究对象，在KA癫痫大鼠模型的基础上，采用多种实验技术，检测癫痫大鼠大脑皮质中TRPC3的表达变化，以期明确TRPC3与癫痫的关系。我们采用半定量RT-PCR方法检测TRPC3在mRNA水平上的差异，采用Western blot法测定各组TRPC3蛋白质表达水平的差异，同时采用免疫组织化学技术直观显示组织中TRPC3表达量的差异。结果显示，无论是mRNA水平，还是蛋白质水平，TRPC3在癫痫大鼠大脑皮质中的含量均明显高于正常对照组。而在癫痫发作后48 h和72 h这两个时间点之间差异无统计学意义。提示TRPC3可能参与癫痫的发生及发展，且在癫痫发作48 h后，其含量不再升高。TRPC3单分子有6个跨膜区(TM1-6)，在TM5与TM6之间有形成孔道的袢，4个单分子TRPC3 TM5与TM6间的袢彼此靠近形成离子通道，经由ROCE和SOCE两种机制，通过与磷脂酶C(phospholipase C，PLC)相偶联的方式被激活[22]，介导Ca2+快速内流，引起去极化到一定程度，触发Na+内流，进而引发一系列迅速的去极化过程，导致兴奋性神经递质过度释放而处于优势，兴奋性和抑制性两大系统失去平衡，诱发癫痫。这其中，TRPC3通过何种途径诱发癫痫，以及癫痫产生后如何引起脑组织的进一步损伤，这些方面的分子机制还需要进一步的研究。

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Up-regulationofTRPC3intheCortexofRatswithKainicAcid-inducedSeizures

Lu Min1，He Qing2，Zhu Xiaoying3

1DepartmentofHumanAnatomyandHistologyandEmbryology，3DepartmentofNosetiology，MedicalCollege，HenanUniversityofScienceandTechnology，Luoyang471023，China2DepartmentofAcupuncture，Wuhan672TraditionalChineseandWesternMedicineHospital，Wuhan430071，China

ObjectiveTo observe the expression change of TRPC3 in cortex of rats with Kainic acid(KA)-induced seizures，and to explore the role of TRPC3 in epileptogenesis.MethodsFifty-four adult Sprague Dawley(SD)rats were randomly divided into two groups(18 for control group，36 for epilepsy group).The behavior of rats was observed and recorded.The epilepsy group was treated with KA(2 μg/kg，about 7 μL，lateral intracerebroventricular injection)，and control group was treated with isotonic Nachloride(equivalent volume with KA，lateral intracerebroventricular injection).For epilepsy group，samples were taken 48 and 72 h after seizure burst.For control group，samples were taken 48 h after isotonic Nachloride injection.The mRNA level of TRPC3 in cortex was detected and recorded by RT-PCR，and the protein level of TRPC3 in cortex was measured by Western blotting，and immunohistochemistry was also used to display the TRPC3 expression in cortex.ResultsThe control group showed no seizure activity，and the epilepsy group showed classical seizure activity(Ⅳ-Ⅴ level)about 5 min after injection and last for several hours.The mRNA and protein levels of TRPC3 in epilepsy group were both higher than those in control group with obvious distinction(P<0.05).ConclusionThe TRPC3 level increases in cortex of rats with KA-induced seizures.These results point out that TRPC3 is possibly involved in epilepsy etiopathogenesis and development.

epilepsy； TRPC3； kainic acid； cortex

卢 敏，女，1979年生，医学博士，讲师，E-mail：364588020@qq.com

R742.1

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.06.008

(2017-04-24 收稿)