‘小金海棠’多酚对高脂小鼠肝组织的影响

王 鹏，韦月平

（辽东学院农学院，丹东 118003）

‘小金海棠’多酚对高脂小鼠肝组织的影响

王 鹏，韦月平

（辽东学院农学院，丹东 118003）

采用饲喂高脂饲料建立高脂小鼠模型，‘小金海棠’多酚（MXP）灌胃给药（50 mg/kg、100 mg/kg）连续7周检测肝组织中甘油三酯（TG）与总胆固醇（TC）水平，并观察肝组织形态，最后检测糖脂代谢途径相关蛋白（IRS、Akt）的表达状况。结果表明：MXP可以降低肝组织中TG和TC水平，并能明显抑制肝细胞损伤，其中100 mg/kg组效果较好；更为重要的是MXP可以显著提高IR和IRS的表达，改善糖脂代谢信号通路。

小金海棠；多酚；高脂

‘小金海棠’（Malus xiaojinensis）是中国自主筛选出的第一个抗缺铁黄叶病的苹果品种，已在国内广泛种植［1］。其果实含丰富的营养成分，特别是多酚类物质可达0.9%左右，包括芦丁、原儿茶酸以及少量对香豆酸和阿魏酸等［2］。研究显示，植物多酚类物质具有超强的抗氧化活性和自由基清除能力，在降血糖、降血脂、保护心脑血管、护肝、抗癌等方面有一定的作用［3-6］。国内外已经开展了很多有关植物多酚的提取研究，但对于‘小金海棠’提取物活性及功能的研究少见。本试验根据‘小金海棠’多酚的药理作用特性，研究其对高脂饮食诱导小鼠肝组织的影响，并对其机制进行探讨，以期为其作为功能性保健品开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

5周龄SPF级雄性KM小鼠，购于辽宁长生生物技术有限公司。

‘小金海棠’多酚（Malus xiaojinensis Polyphenols，MXP）采用乙醇提取，大孔树脂纯化，纯度＞90%。

甘油三酯（TG）检测试剂盒、总胆固醇（TC）检测试剂盒及总RNA提取试剂盒购自南京建成生物工程研究所；First Strand cDNA Synthesis Kit及All-in-OneTMqPCRMix购自上海索莱宝生物科技有限公司；苏木素伊红染色试剂盒（HE试剂盒）购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 仪器与设备

5430 R型台式冷冻离心机，德国 Eppendorf；DK-S22型电热恒温水锅 Electric Water Bath；Infinite F200/M200型酶标仪，TECAN公司；ABI 7500定量PCR仪，美国应用生物系统公司；组织切片机，德国Leica公司。

1.3 方法

1.3.1 动物处理

小鼠经1周适应期后，随机分成试验组与对照组。对照组饲喂正常饲料（NFD），试验组饲喂高脂饲料（HFD）。试验组分为3个小组，小鼠每天分别进行相应的灌胃处理，即HFD组（生理盐水）、低剂量组（HFD+50 mg/kg MXP）和高剂量组（HFD+100 mg/kg MXP）。每周定时称量小鼠体重一次，并观察其活动及精神状态，7周后，眼球采血，处死后摘取肝脏［7］。饲料成分如表1。

表1 正常饮食和高脂饮食配方Table 1 The formula of normal diet and high-fat diet %

1.3.2 肝组织TG与TC水平检测

取肝组织1 g，加入9mL生理盐水，制成匀浆。按照试剂盒操作方法测定肝组织TG（甘油三酯）与TC（总胆固醇）含量。

1.3.3 HE染色

取小鼠肝脏用福尔马林液固定，常规石蜡包埋切片，切片常规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗，苏木素染色5 min，自来水冲洗，盐酸乙醇分化30 s，自来水浸泡15 min，置伊红液2 min，常规脱水、透明、封片，用显微镜观察并拍照。

1.3.4 Western Blotting免疫印迹法［8］

定量称取肝组织于小管中剪碎，加入细胞裂解液于冰上裂解30 min，于4℃、13 500 r/min离心15 min，上清液即为肝组织总蛋白。12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后将其转移到硝酸纤维素膜上，并用以下抗体进行免疫印迹：anti-IRS、anti-Akt及 anti-β-actin（Bio Basic Inc.，加拿大）。

1.3.5 统计分析

试验结果采用平均值±标准差格式。采用SPSS软件进行单因素方差分析，P＜0.05为5%差异显著，P＜0.01为1%差异显著，P＜0.001为1‰差异显著。

2 结果与分析

2.1 ‘小金海棠’多酚（MXP）对小鼠肝脂指标的影响

如图1所示，肝组织中TG与TC含量为试验组（HFD+MXP）低于对照组（NFD）。随着MXP的加入，TG与TC含量呈下降趋势，且随着剂量的增加效果越明显，其中100 mg/L MXP组小鼠肝中TG水平显著（P＜0.001）低于NFD组。

2.2 ‘小金海棠’多酚（MXP）对小鼠肝脏中炎症因子表达的影响

肝组织病理学观察是评价肝组织形态和组织学的重要指标。如图2所示，显微镜下（16×40倍）观察到对照组小鼠的肝组织结构排列整齐，中心静脉的大小正常，肝细胞形态清晰，膜完整。长期高脂饮食（HFD）则造成大量肝细胞脂肪累积变性和炎性细胞浸润，细胞排列层次紊乱且细胞膜受到损坏。MXP（50 mg/kg、100 mg/kg）补充明显逆转了上述高脂饮食导致的不利变化，且100 mg/kg剂量的效果更佳。

图1 ‘小金海棠’多酚（MXP）对小鼠肝组织中TG与TC水平的影响Fig.1 Effect of MXP on the level of TG and TC in liver tissues ofm ice

图2 小金海棠多酚（MXP）对小鼠肝组织病理的影响Fig.2 Effect of MXP on liver pathology in m ice

2.3 ‘小金海棠’多酚（MXP）对小鼠糖脂代谢通路相关蛋白表达的影响

胰岛素受体底物（IRS）与蛋白激酶B（Akt）是体内能量代谢的关键蛋白，直接调控着细胞对葡萄糖的吸收和利用，间接调控着脂肪的代谢［9-10］。以β-actin内参抗体作为Western Blotting内部参照指数。如图3所示，对照组（NFD）的IRS与Akt表达量明显高于高脂饮食组（HFD），在经过7周的MXP灌胃后，二者在HFD组的表达量明显得到提升。试验结果显示，MXP能明显改善糖脂代谢信号通路。

图3 ‘小金海棠’多酚（MXP）对小鼠肝组织糖脂代谢通路相关蛋白表达的影响Fig.3 Effect of MXP on the glycolipid metabolic pathway related protein in liver tissue ofm ice

3 结论

本试验在对小鼠进行高脂饲料饲喂的同时，又对其进行MXP灌胃7周，相比于只进行高脂饲料饲喂的小鼠，肝组织中TG、TC水平明显下降，可能正是因为MXP可以降低肝组织中TG的水平，从而降低了血脂水平。显微镜观察结果表明，MXP处理还能显著降低高脂饮食引起的肝组织炎症水平升高，肝脏作为机体的主要代谢器官，其炎性细胞因子的过度累积会造成肝细胞损伤引起代谢功能障碍，从而导致脂肪过度生成［11-13］。试验表明，‘小金海棠’多酚能降低肝脏的炎症水平，改善肝细胞的生存微环境，从而起到护肝的作用，进而调节血脂平衡，许多国内外学者的研究也证实了这点［14-15］。IRS与Akt是糖脂代谢信号通路的关键蛋白，研究表明肝脏中缺失IRS与Akt会造成胰岛素耐受，并会丧失对高糖高脂饮食的反应，使肝脏“认为”机体处于禁食状态，作为响应，肝脏会继续生成葡萄糖从而为细胞持续供给富能分子，致使脂质过度积累［16-18］。MXP对于这种状况有着良好的改善作用，可为解决胰岛素耐受提供新的思路。

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Effects of Malus xiaojinensis polyphenols on high fat liver tissue ofmouse

WANG Peng，WEIYue-ping

（Agricultural College，Eastern Liaoning University，Dandong118003，China）

Hyperlipemia mice model was established by feeding high-fat diet and MXP gavage administration（50 mg/kg and 100 mg/kg）were treated tomice for 7 weeks.The levels of triglyceride（TG）and total cholesterol（TC）in liver tissue were detected，and themorphology of liver tissueswas observed.Finally，the expression of related proteins（IRS，Akt）in the pathway of glucose and lipidmetabolism was detected.The results showed that MXP could reduce the level of TG and TC in liver tissue and inhibit the injury of liver cells obviously.The effect of 100 mg/kg group was better.More importantly，MXP could significantly improve the expression of IR and IRS and improve the signaling pathway of glycolipid metabolism.

Malus xiaojinensis；Polyphenols；Hyperlipidemia

2016-06-21

辽东学院青年基金项目（2016QN029）“小金海棠多酚对肝脏功能的改善及机制研究”

王鹏（1970—），男，硕士，副教授，研究方向：植物次生物提取。E-mail：58993698＠qq.com，Tel：18242588906 13342171866

R282.71

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1000-3924（2017）06-053-04

闫其涛）