酶解与包合技术制备水溶性花粉的比较研究（续）

刘佳霖 殷素会 高丽娇 曹 兰 罗文华 程 尚

（重庆市畜牧科学院，荣昌 402460）

2.4.5 纤维素酶+β-环糊精：使用1 mol/L的HCl调节蜂花粉溶液pH=5.2，加入纤维素酶0.750 g（酶添加量为1500 U/g），65℃条件下搅拌反应4 h。反应结束后，于100℃下加热5 min灭酶，冷却。反应结束后，于100℃下加热5 min灭酶，冷却。使用1 mol/L的氢氧化钠调节蜂花粉水溶液pH=8.7，加入β-环糊精6.250 g（与蜂花粉质量比为1:4），37℃下水浴磁力搅拌4 h，过滤。

2.4.6 果胶酶+碱性蛋白酶：使用1 mol/L的HCl调节蜂花粉溶液pH=4.0，加入果胶酶0.469 g（酶添加量为1500 U/g），40℃条件下搅拌反应4 h。反应结束后，于100℃下加热5 min灭酶，冷却。使用1 mol/L的NaOH调节蜂花粉溶液pH=9.0，加入碱性蛋白酶1.25 g（酶添加量为1500 U/g），50℃条件下搅拌反应4 h。反应结束后，于100℃下加热5 min灭酶，过滤。

2.4.7 果胶酶+β-环糊精：使用1 mol/L的HCl调节蜂花粉溶液pH=4.0，加入果胶酶0.4688 g（酶添加量为1500 U/g），40℃条件下搅拌反应4 h。反应结束后，于100℃下加热5 min灭酶，冷却。使用1 mol/L的氢氧化钠调节蜂花粉水溶液pH=8.7，加入β-环糊精6.250 g（与蜂花粉质量比为1∶4），37℃下水浴磁力搅拌4 h，过滤。

2.4.8 脂酶+碱性蛋白酶：使用1 mol/L的HCl调节蜂花粉溶液pH=5.5，加入脂酶3.750 g（酶添加量为1500 U/g），40℃条件下搅拌反应4 h。反应结束后，于100℃下加热5 min灭酶，冷却。使用1 mol/L的NaOH调节蜂花粉溶液pH=9.0，加入碱性蛋白酶1.250 g（酶添加量为1500 U/g），50℃条件下搅拌反应4 h。反应结束后，于100℃下加热5 min灭酶，过滤。

2.4.9 脂酶＋β-环糊精：使用1 mol/L的HCl调节蜂花粉溶液pH=5.5，加入脂酶3.750 g（酶添加量为1500 U/g），40℃条件下搅拌反应4 h。反应结束后，于100℃下加热5 min灭酶，冷却。使用1 mol/L的氢氧化钠调节蜂花粉水溶液pH=8.7，加入β-环糊精6.250 g（与蜂花粉质量比为1:4），37℃下水浴磁力搅拌4 h，过滤。

2.4.10 β-葡萄糖苷酶+碱性蛋白酶：使用1 mol/L的氢氧化钠调节蜂花粉溶液pH=5.5，加入葡萄糖苷酶0.189 g（酶添加量为1500 U/g），50℃条件下搅拌反应4 h。反应结束后，于100℃下加热5 min灭酶，冷却。使用1 mol/L的NaOH调节蜂花粉溶液pH=9.0，加入碱性蛋白酶1.250 g（酶添加量为1500 U/g），50℃条件下搅拌反应4 h。反应结束后，于100℃下加热5 min灭酶，过滤。

2.4.11 β-葡萄糖苷酶+β-环糊精：使用1 mol/L的氢氧化钠调节蜂花粉溶液pH=5.5，加入葡萄糖苷酶0.189 g（酶添加量为1500 U/g），50℃条件下搅拌反应4 h。反应结束后，于100℃下加热5 min灭酶，冷却。使用1 mol/L的氢氧化钠调节蜂花粉水溶液pH=8.7，加入β-环糊精6.250 g（与蜂花粉质量比为1:4），37℃下水浴磁力搅拌4 h，过滤。

2.5 蛋白质及黄酮含量测定

2.5.1 蛋白质含量测定：标准曲线测定：采用考马斯亮蓝蛋白质定量试剂盒方法[21]，将0、40、80、120、160、200、240 μl牛血清蛋白BSA标准溶液分别加入试管中，加入PBS补足600 μl（600、560、520、480、440、400、360 μl ），向各试管加入11.40 mL考马斯亮蓝染液，混匀，室温放置5～10 min，分别在595 nm处记录吸光值。

测定蜂花粉水溶液的蛋白质含量：取50 ml产物溶液定容至500 ml，将适当体积的样品加入到试管中，并用PBS补足到600 μl，在向各试管加入11.4 ml考马斯亮蓝染液，混匀，室温放置5～10 min，分别在595 nm处记录吸光值。

按下列公式计算水溶性蜂花粉的蛋白质提取率：水溶性蛋白质提取率（%）＝

2.5.2 黄酮含量测定：标准曲线的制作：精密吸取芦丁标准溶液（1000 μg/ml）：0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 ml于10 ml比色管中，加5% NaNO2溶液0.3 ml，摇匀后放置6 min，加入10% Al(NO3)3溶液0.3 ml，摇匀后静置6 min，加入4%NaOH溶液4 ml在用乙醇或者水定容，摇匀，于波长510 nm处测定吸光度。对所测得的数据采用直线回归法计算产物黄酮含量

出标准曲线的回归方程，并以吸光度为横坐标，对照品浓度为纵坐标绘制标准曲线[22]。

样品的测定方法：精密吸取1 ml样品溶液置于10 ml容量瓶中，加入乙醇（加入4 ml）至5 ml，加入NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色体系[22]，摇匀，以相应试剂做空白，于510 nm处测定吸光值，并计算样品中总黄酮的含量。

按下列公式计算水溶性蜂花粉的黄酮提取率：

2.6 统计分析

采用SPSS16.0软件进行统计学分析，试验数据以“平均值±标准差”表示，方差分析使用One-way ANOVA的LSD法，显著水平P＜0.05。3 结果与分析

3.1 蛋白质及黄酮标准曲线

以BSA（牛血清标准蛋白）为横坐标x（μl），595 nm处吸光值为纵坐标y作图，制作的标准曲线在0～240 μl BSA范围内符合方程y=0.0038x+0.0373，R2=0.996。

以芦丁标准品为横坐标x（μg），510 nm处吸光值为纵坐标y作图，制作的标准曲线在0～500 μg 芦丁标准品范围内符合方程y=0.0011x-0.0083，R2=0.999。

3.2 酶解与包合技术制备水溶性花粉的比较

酶解与包合技术制备水溶性蜂花粉的结果如表1所示。单一酶制剂或包合材料制备水溶性花粉，水溶性蛋白质及黄酮提取率最高的为碱性蛋白酶及环糊精2:1，水溶性蛋白质提取率分别为84.55%和84.33%，黄酮提取率分别为19.51%和18.50%。采用酶解与包合复合技术制备水溶性花粉，水溶性蛋白质提取率最高的为果胶酶+β-环糊精和纤维素酶+β-环糊精，水溶性蛋白质提取率分别为95.40%和88.91%；水溶性黄酮提取率最高的为纤维素+碱性蛋白酶和纤维素酶+β-环糊精，黄酮提取率分别为35.93%和37.86%。综合比较，采用纤维素酶+β-环糊精制备水溶性花粉能够获得较高的水溶性蛋白质提取率和黄酮提取率，与空白对照相比可提高水溶性蛋白质提取率120.95%，提高水溶性黄酮提取率105.98%，显著高于单一酶制剂或包合材料制备水溶性花粉的效果。

表1 酶解与包合技术制备水溶性花粉的比较试验结果

4 讨论

蜂花粉是一种天然、绿色、安全的保健品[1,5,6]，水溶性、稳定性及感官特性是限制其深加工及广泛应用的关键难题。目前，蜂花粉的深加工通常采用真空冷冻干燥技术及超微粉碎技术制备高活性、低致敏的产品，但其理化性状并没有得到很大的改善，主要活性成分的提取仍处于发展阶段。酶解改性技术是目前使用最广泛的蛋白质改性技术，通过多种酶的内切或外切作用可以改变物料的理化特性和功能特性，该技术反应速度快、条件温和、无有毒有害物质产生，能够保证物料中的活性成分得到有效的保留[23,24]。本研究比较了多种蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、脂酶及葡萄糖苷酶制备水溶性花粉的效果，结果显示，不同的酶制备水溶性蜂花粉的效果差异较大，碱性蛋白酶制备的水溶性蜂花粉蛋白质提取率和黄酮提取率最高，分别为84.55%和19.51%。与前人的结果一致[7]，碱性蛋白质制备水溶性蜂花粉的效果显著高于其他酶。

包合技术是一种重要的蛋白质物理改性技术，一般采用环糊精为辅料，包合物料中的多种小分子物质，对其营养成分影响较小[25]。该技术在改善物料水溶性、稳定性及感官特性等方面具有十分重要的作用，已广泛应用于食品及医药等多个产业[26,27]。本研究比较了不同环糊精添加量对制备水溶性蜂花粉的影响，结果显示，环糊精添加量对包合技术制备水溶性蜂花粉的影响较小（P＜0.05）, 环糊精2:1制备的水溶性蜂花粉蛋白质提取率和黄酮提取率最高，分别为84.33%和18.50%。包合技术和酶解改性技术制备水溶性蜂花粉的效果差异不显著。

本研究在单一使用酶解与包合技术的基础上进一步开展蛋白酶+纤维素酶、果胶酶、脂酶、葡萄糖苷酶以及环糊精+纤维素酶、果胶酶、脂酶、葡萄糖苷酶的复合工艺制备水溶性蜂花粉的比较研究。综合结果显示，采用纤维素酶+β-环糊精制备水溶性花粉的效果最好，其水溶性蛋白质提取率为88.91%，水溶性黄酮提取率高达37.86%，显著高于单一酶制剂或环糊精制备水溶性花粉的效果。由此，本研究认为，多种工艺的复合使用有利于蜂花粉深加工产业的进一步发展，在改善蜂花粉理化性状，分离、纯化蜂花粉主要活性物质方面具有十分广阔的发展前景。

5 结论

采用纤维素酶+β-环糊精制备水溶性花粉能够获得较高的水溶性蛋白质提取率和黄酮提取率，与空白对照相比可提高水溶性蛋白质提取率120.95%，提高水溶性黄酮提取率105.98%，显著高于单一酶制剂或包合材料制备水溶性花粉的效果。多种技术的复合使用，有助于蜂花粉深加工的进一步发展。

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3.价格保护型

分别受到国家扶贫资金资助、扶持的（产销一体化）经营主体与养蜂合作社、养蜂协会、养蜂户之间，有严格的合同契约关系，由经营主体负责回收、加工、包装蜂产品，统一包装、统一品牌销售。双方确定提供蜂产品的数量、质量、价格，不符合质量的产品不予收购。价格原则上随行就市，在保护价的基础上可适当上下调整。保护价的制定应考虑到双方的利益，除保证养蜂户有基本收益外，也要确保经营主体在扣除加工、营销成本后（如包装费用、加工损耗、检测费用、人工成本、厂房设备折旧、品牌建设、市场营销等），有利可图，正向运转。这种机制一方面解决了蜂农产品卖难的问题，另一方面为企业建立了可靠的原料基地。

4.利益均衡型

当产业发展到一定阶段，具有一定规模，经营主体具备了较强的实力后，也可发展成紧密型“公司+合作社+农户”的生产经营模式。经营主体除采取制定保护价等方式保护农户的利益外，在扣除相应的公积金、公益金之后，其销售环节中的部分利益还可按一定比例返还给农户，尽可能均衡公司与农户的利益。

除了以上几种单独的利益分配机制外，也可以采取混合经营的方式，与不同对象，分别按上述不同的机制进行合作与利益分配。

贵州省生态环境好，大多数地方蜜粉源植物丰富，在当前“大生态、大健康、大扶贫”的大好形势下，只要各级地方政府充分认识到科学技术在养蜂扶贫中的重要作用，认真抓好产业扶贫的组织架构，着力培育新型经营主体，努力提高蜂农的组织化程度，处理好各方面的利益联结机制，养蜂就一定会在扶贫攻坚战中发挥重要作用，真正实现“小蜜蜂、大产业”，通过产业带动，使更多的农户达到脱贫致富奔小康的目的。