烟曲霉素对蜜蜂微孢子虫治疗效果研究

一、前言

烟曲霉素是一种从烟曲霉中分离得到的抗生素，是目前唯一一种能够有效治疗微孢子虫病的药物，近六十年来被广泛应用于西方蜜蜂微孢子虫病的治疗。最近发现它也能抑制东方微孢子虫的繁殖。

2004年，Huang WF等发现，从中华蜜蜂中提取的东方孢子虫可以感染意大利蜜蜂，这引起了人们对于蜜蜂健康的担忧。在意大利和西班牙，蜜蜂的数量逐年下降，这与孢子虫病的盛行不无关系。Pajuelo AG和Williams GR等人研究证明，在一定的浓度下，烟曲霉素不但可以控制西方孢子虫的繁殖，对东方孢子虫同样有效。这导致烟曲霉素的销量上升，蜂产品中抗生素的残留情况也随之加剧。因此，在美国，烟曲霉素是禁止在流蜜期使用的，蜂农在晚秋和早春施用烟曲霉素用作对微孢子虫病的预防，流蜜期间烟曲霉素会逐渐降解，整个禁止期长达六个月。

这种间歇式的给药方式使蜜蜂和微孢子虫持续处于烟曲霉素的暴露当中，尽管这种方式有利于形成烟曲霉素抗性的微孢子虫，但是Higes M，Cox-Foster DL等人研究证明，西方孢子虫并没有形成抗性，而东方孢子虫却表现出对烟曲霉素的不敏感性，这使东方孢子虫取代西方孢子虫成为一个趋势。

烟曲霉素能够抑制兔脑炎原虫（一种以人为寄主的微孢子虫）的甲硫氨酸氨肽酶2（MetAP2），大多数的真核生物有两种MetAP的亚型，MetAP1和MetAP2，其中MetAP2是烟曲霉素的靶点蛋白。然而，MetAP2蛋白基因在所有的真核生物中有60%的同源性，因此，烟曲霉素虽然被用作治疗微孢子虫和某些癌症的药物，同时也会对人和其它脊椎动物的健康造成一定的危害。Webster TC和Rada V已经证明，摄入烟曲霉素的蜂王和工蜂寿命会缩短，但是这种抗生素对蜜蜂的潜在毒性目前研究的还较少。

本文中，Wei-Fone Huang等用低浓度的烟曲霉素来探究降解过程中的烟曲霉素对东方和西方孢子虫的影响。为了探明不同种属的微孢子虫（东方孢子虫、西方孢子虫、熊蜂孢子虫）对烟曲霉素敏感性的差异，他们比较了三种孢子虫的MetAP2蛋白的基因序列。此外，他们对未感染微孢子虫而使用了烟曲霉素的蜜蜂中肠蛋白进行了二维电泳。结果显示：低浓度的烟曲霉素不但无法抑制微孢子虫的增殖，反而会干扰蜜蜂中肠组织的生理机能。

二、实验内容与结果

1.烟曲霉素给药组微孢子虫繁殖情况

感染孢子虫的蜜蜂给以不同浓度的烟曲霉素处理（25 mg/l以及0.02×，0.01×，0.002×，0.001×，0.0002×，0.00006×，0.00001×，0.0000033×，0×），结果显示，东方孢子虫和西方孢子虫的繁殖情况明显不同。

对于0.01×和0.001×给药组，东方孢子虫的数量分别比西方孢子虫高165%和129%，东方孢子虫烟曲霉素空白组的数量比西方孢子虫高30%。1.0×烟曲霉素对东西方孢子虫均有显著抑制作用。0.04×浓度组的东方孢子虫数量显著低于烟曲霉素空白组。0.02×浓度组抑制作用不显著，并且在后期有一个重新爆发的趋势。0.01×浓度组孢子数与烟曲霉素空白组孢子数相似。作为对照，西方孢子虫在0.01×浓度时即受到抑制。浓度为0.002×时，烟曲霉素对两种孢子虫均失去效果。浓度在0.0000033×～0.01×范围内，东方孢子虫数量明显高于烟曲霉素空白组。而对于西方孢子虫来说，浓度≤0.002×范围内，孢子数量与烟曲霉素空白组没有明显差异。

2.MetAP2蛋白基因序列的比较

比较了东方孢子虫、西方孢子虫、熊蜂孢子虫的MetAP2基因，并与蜜蜂和人的MetAP2蛋白基因进行比较。熊蜂孢子虫为868 bp（GenBank编号：JQ927011），西方孢子虫为926 bp（GenBank编号：JQ927010）。这些序列在C末端缺少65个氨基酸序列的碱基对，N末端缺少2个氨基酸序列的碱基对。但是包含所有的烟曲霉素结合位点和必要的金属离子配位点序列，足以用来探究烟曲霉素和MetAP2的相互作用。

结果显示，东方孢子虫和熊蜂孢子虫相似度为83%，东方孢子虫和西方孢子虫相似度73%，西方孢子虫和熊蜂孢子虫相似度82%。

3.烟曲霉素处理组蜜蜂中肠的蛋白提取和2-D凝胶电泳

0.0 ，1.0，0.01和 0.001×25 mg/l烟曲霉素处理组的未感染蜜蜂用于蛋白试验。通过对二维电泳蛋白点的有无、数量和位置进行鉴定比较烟曲霉素对蜜蜂中肠蛋白的影响。ESI-LC/MS和Mascot (Matrix Science)数据库鉴定出45种与能量代谢、线粒体、细胞结构和运输有关的蛋白。在不同烟曲霉素浓度组中，α-肌动蛋白的亚型处于凝胶的不同位置，数量有所增加。α-葡萄糖苷酶Ⅱ的亚型也有所变化，其三种亚型在所有的处理组中都被发现，但是其比率有所不同。位于线粒体中的H+转运ATP合酶β亚基的亚型Ⅰ，在不同的烟曲霉素浓度处理组中呈现不同的分子质量。另外，在所有烟曲霉素浓度组中，均发现一种依赖电压的阴离子选择通道蛋白，其没有出现在烟曲霉素空白组中。

4.相关基因和蛋白的序列号信息

西方孢子虫和熊蜂孢子虫MetAP2蛋白基因的部分序列可以在GenBank数据库中找到，序列号分别是JQ927010和JQ927011。东方孢子虫MetAP2蛋白的GenBank基因序列号为XM002996491。蜜蜂和人的MetAP2蛋白的氨基酸序列号分别是XP624161 和 NP006829，果蝇是AAC05144，酵母是S45411，兔脑炎原虫是AF440270，hellem大肠杆菌是AY224694，intestinalis大肠杆菌是AY224693。

三、讨论

低浓度的烟曲霉素可以促进东西方孢子虫的繁殖，这种情况在东方孢子虫中更加严重，低浓度烟曲霉素或许能影响孢子虫和宿主的相互关系。西班牙的一个蜂场试验报道，施用烟曲霉素三个月以后其浓度会降到0.001×，虽然美国联邦药物管理局禁止在流蜜期使用烟曲霉素，市场上蜂蜜检测到的烟曲霉素的浓度仍然在60 ng/g，大约是0.0024×浓度。经过计算，烟曲霉素在蜂场中的降解速度大约是-log10/月。利用这个计算结果，推测使用烟曲霉素以后，东方孢子虫重新增殖的时间大约是2～5.5个月，后期还需要更多的蜂场试验来验证这个推测。

相对于西方孢子虫，在使用烟曲霉素以后，东方孢子虫能够更快的重新增殖，同一条件下其孢子虫数量是西方孢子虫的两倍，而在未使用烟曲霉素的情况下，东方孢子虫的数量仅稍多于西方孢子虫。对烟曲霉素的低敏感性，预示着东方孢子虫可能会取代西方孢子虫，成为蜜蜂孢子虫病的主要病原体。

对三种孢子虫的MetAP2基因序列的比较也许可以揭示不同孢子虫对烟曲霉素敏感性不同的原因，对于MetAP2的基因序列和氨基酸序列来说，东方孢子虫和熊蜂孢子虫更为接近，而系统发生树分析显示，西方孢子虫和熊蜂孢子虫亲缘关系更近（熊蜂孢子虫不受烟曲霉素控制）。这说明三种孢子虫的MetAP2没有明显的差别，预示着MetAP2可能不是唯一影响烟曲霉素药效的因素。蜜蜂与孢子虫MetAP2高度的相似性预示着东方孢子虫大量增殖时，蜜蜂也会受到某种潜在的影响。

MetAP2参与很多蛋白的翻译修饰，但是其全部功能还不为所知。使用了烟曲霉素的蜜蜂中肠蛋白分析结果表明，低浓度的烟曲霉素不但会加速微孢子虫的繁殖，反而会影响蜜蜂中肠正常的生理机能。与高浓度的烟曲霉素相比，0.001×浓度时，与结构和代谢相关的蛋白变化微弱，但是仍然可以观察到。虽然没有找到能够抑制微孢子虫的蛋白，但是一些蛋白的亚型例如α-肌动蛋白、葡萄糖苷酶，在不同烟曲霉素浓度处理组有所变化。肌动蛋白的变化可以作为蜜蜂成功感染胞内顶复门寄生虫的标志，α-葡萄糖苷酶Ⅱ亚型是碳水化合物代谢所必须，其它一些变化的蛋白位于线粒体，与能量的代谢有关。这些蛋白亚型的变化有可能与MetAP2的蛋白修饰作用被干扰有关。

杀虫剂和东方孢子虫之间可能的协同作用之前已经被报道过，我们发现烟曲霉素的作用与这些杀虫剂高度的相似，烟曲霉素降解成低浓度以后这种协同作用会增强。烟曲霉素的使用是为了控制微孢子虫的繁殖，但是这种抗生素很有可能会导致东方孢子虫的盛行和传播。虽然说有必要进行更多的蜂场试验来验证烟曲霉素对孢子虫是否有效，但是更重要的是找到一种控制孢子虫的新方法。以孢子虫为靶点，又不影响蜜蜂的生理机能的新的药物的研制对于控制蜜蜂微孢子虫的发展至关重要。