麝香通心滴丸改善心肌梗死小鼠微循环障碍的作用机制

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·基础医学论著/研究·

麝香通心滴丸改善心肌梗死小鼠微循环障碍的作用机制

张艳达，施珊岚，厉娜，贺治青，吴宗贵，梁春

目的分析麝香通心滴丸对心肌梗死小鼠微循环障碍的改善作用并探讨其相关机制。方法选用6周～8周C57雄性小鼠30只，随机分为假手术对照组、微循环障碍模型组[心肌梗死手术合并脂多糖诱导(MI+LPS)组]、模型联合麝香通心滴丸干预(SXTXDW)组。实验终点处死动物，检测内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、神经型一氧化氮合酶(nNOS)在提睾肌的表达。结果与假手术对照组比较，MI+LPS组微循环血流速度明显降低(P<0.05)，微循环中白细胞黏附数目明显增多(P<0.05)。与MI+LPS组比较，SXTXDW组微循环血流速度明显增快(P<0.05)，白细胞黏附数量明显减少(P<0.05)，且提睾肌eNOS和nNOS表达明显增强(P<0.05)。结论麝香通心滴丸可改善心肌梗死小鼠微循环障碍，其机制可能与内源性一氧化氮产生增加、白细胞黏附减少等有关。

心肌梗死；微循环障碍；麝香通心滴丸；脂多糖

冠心病严重威胁人类健康，主要病因为冠状动脉狭窄导致心肌供血不足。由于心绞痛行冠状动脉造影检查病人中，20%～30%病人造影结果显示，心外膜冠状动脉无明显狭窄或闭塞，有研究认为这种胸痛与冠状动脉微血管功能异常有关，故称为微血管性心绞痛(microvascularangina，MVA)或心脏X综合征[1-3]。冠脉微循环是指心脏中直径<300μm微动脉、毛细血管和微静脉构成的系统。冠脉微循环系统受到一种或多种不良因素影响出现异常后即发生冠脉微循环障碍，也有学者将后者称为冠脉微血管功能不全。

根据合并疾病情况，Crea等[4]将冠状动脉微循环障碍划分为4种类型：①不伴有心肌病和阻塞性冠心病的冠脉微循环障碍；②伴心肌病的冠脉微循环障碍；③冠脉微循环障碍伴阻塞性冠心病；④医源性冠脉微循环障碍。目前冠脉微循环障碍机制多认为是内皮功能紊乱，但该病发病是多因素、多通路共同作用的结果，故微循环障碍的多种机制有待进一步研究。治疗方面，目前尚缺乏有力循证证据支持某类药物对冠脉微循环的疗效。据报道，通心络胶囊、麝香保心丸、麝香通心滴丸等对冠脉微循环有一定的改善作用，但均为小样本单中心研究[5-6]。Gunes等[7]给予冠脉慢血流病人奈必洛尔(每日5mg)干预3个月，与基线比较，病人左心室收缩和舒张功能指标均明显改善，进一步研究发现，奈必洛尔连续干预6个月后，慢血流病人除血流增快外，异常升高的丙二醛、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶及一氧化氮(NO)活性均显著降低[8]。本研究分析麝香通心滴丸改善冠脉微循环障碍的作用机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器 麝香通心滴丸由内蒙古康恩贝药业有限公司提供(每粒35mg)；脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)和罗丹明6G购自Sigma公司(美国)；异氟烷麻醉剂购自深圳瑞沃德公司；引物由上海捷瑞生物工程有限公司提供；PowerLab数据采集分析系统购自澳大利亚埃德仪器有限公司。

1.2 实验动物及分组SPF级6周～8周雄性C57小鼠30只，体重20g±2g，由中国科学院上海药物研究所实验动物中心提供。小鼠随机分为3组，每组10只。假手术对照组：异氟烷麻醉下行开胸但冠状动脉不结扎处理。微循环障碍模型组[心肌梗死手术合并脂多糖诱导(MI+LPS)组]和模型联合麝香通心滴丸干预(SXTXDW)组：在无呼吸机支持下小鼠心肌梗死模型制备[9]，使用异氟烷诱导麻醉小鼠，仰面固定后给予连续纯氧负载异氟烷持续麻醉，保持气体流量在0.5mL/min，酒精消毒胸前区手术区域后，沿肋骨方向剪开皮肤及皮下组织暴露肋间隙，蚊式钳撕开肋间肌肉并顺势撑开肋间隙，暴露并挤出小鼠心脏至体外，直视下快速结扎心脏冠脉前降支，可见心前区运动消失并膨出，小心止血并回纳至胸腔，荷包缝合胸部皮肤封闭手术破口，结束手术，脱离麻醉机复苏小鼠直至其苏醒，24h后心肌梗死小鼠行标准Ⅱ导心电图检测，剔除MI+LPS组和SXTXDW组ST段无明显抬高小鼠。

1.3 提睾肌微循环血流速度测定 心肌梗死手术1周后假手术对照组小鼠腹腔注射200μL生理盐水，而MI+LPS组和SXTXDW组小鼠腹腔注射脂多糖溶液(2mg/kg)。30min后腹腔麻醉各组小鼠，体式显微镜下分离右侧提睾肌并展开，在正置显微镜下观察并记录微血管血流速度。假手术对照组和MI+LPS组予以生理盐水10μL舌下滴注；SXTXDW组予以麝香通心滴丸溶液(18mg/mL)10μL舌下滴注。使用高速摄像系统OLYMPUSDP71记录图像及动态视频，随后使用ImageProPlus6.0图像分析软件，选取直径20μm～40μm，长度为200μm微血管分析相关指标。使用高速摄像系统OLYMPUSDP71记录动态视频，使用ImageProPlus6.0图像分析软件离线测量并记录给药后0min、10min、20min、30min、40min、50min和60min提睾肌微血管血流速度。

1.4 白细胞黏附 不同干预前10min，经小鼠颈静脉注射荧光示踪剂罗丹明6G(5mg/kg)后即在荧光显微镜(波长543nm)下连续观察并经数字化记录。相关动态视频经ImageProPlus6.0图像分析软件离线分析。血管内白细胞附着于血管壁超过30s定义为白细胞黏附，选择200μm直径微血管进行计数，计算每毫米黏附的白细胞数量。选择干预后60min进入稳态后分析。

1.5 提睾肌内皮型一氧化氮合酶(eNOS)和神经型一氧化氮合酶(nNOS)mRNA相对表达量 3组小鼠经不同干预60min后，剪去其提睾肌，称重。使用Trizol提取提睾肌组织总RNA，根据PrimeScript®RTMasterMix试剂盒说明进行逆转录获得cDNA，采用SYBR®PremixExTaqTM试剂盒配制10μL反应体系进行qPCR，检测eNOS和nNOSmRNA相对表达量，采用肌动蛋白(β-actin)作为内参。所需检测基因eNOS和nNOS的qPCR引物序列见表1。

表1 qPCR引物序列

2 结 果

2.1 各组小鼠干预后提睾肌微循环血流速度比较 与假手术对照组比较，MI+LPS组小鼠血流速度明显减慢，提示微循环障碍造模成功。而与MI+LPS组比较，SXTXDW组提睾肌微循环血流速度10min开始明显增快，至30min增至最高流速，且可稳定较长一段时间，10min～60min血流速度差异有统计学意义(P<0.05)，表明麝香通心滴丸可显著减轻上述病理刺激因素所诱发的微循环障碍。详见表2。

表2 各组小鼠干预后提睾肌微循环血流速度比较(±s) mm/s

2.2 各组小鼠干预后微循环白细胞黏附数量比较 与假手术对照组比较，MI+LPS组提睾肌微血管内白细胞黏附数目明显增多；与MI+LPS组小鼠比较，麝香通心滴丸干预可显著降低微循环中白细胞的黏附，差异有统计学意义(P<0.05)，表明麝香通心滴丸可减轻心肌梗死联合LPS诱导微循环障碍的白细胞黏附。详见表3。

表3 各组小鼠干预后微循环白细胞黏附数量比较(±s) 个/mm

2.3 各组小鼠提睾肌eNOS和nNOSmRNA相对表达量 与假手术对照组比较，MI+LPS组提睾肌eNOS和nNOSmRNA相对表达量明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)，考虑心肌梗死手术合并LPS诱导破坏内皮细胞功能。与MI+LPS组比较，SXTXDW组提睾肌eNOS和nNOSmRNA相对表达量明显增强，差异有统计学意义(P<0.05)，表明麝香通心滴丸改善小鼠微循环障碍有可能与NO合成相关通路有关。详见图1、图2。

注：与假手术对照组比较，*P<0.05；与MI+LPS组比较，#P<0.05。

图1小鼠提睾肌eNOS基因表达水平

注：与假手术对照组比较，*P<0.05；与MI+LPS组比较，#P<0.05。

图2小鼠提睾肌nNOS基因表达水平

3 讨 论

麝香通心滴丸由人工麝香、人参茎叶总皂苷、蟾酥、丹参、人工牛黄、熊胆粉和冰片等七味中药组成。具有芳香益气通脉，活血化瘀止痛之功效。Lin等[10]对急性心肌梗死造模大鼠采用麝香通心滴丸干预，发现麝香通心滴丸具有心肌保护、抗细胞凋亡等作用，并可显著改善心肌缺血和维持正常心功能。Chen等[11]通过色谱分析法成功从麝香通心滴丸中分离包括三萜皂苷、蟾蜍二烯羟酸内酯和胆汁酸等41种组分，为今后研究该复方中药内化学组分的作用及其作用机制奠定基础，也有利于传统中药的发展。

目前冠脉微循环障碍发病机制尚不明确，无针对该病的特效药物。因此，探讨冠脉微循环障碍机制，并筛选对该病疗效确切的药物尤为重要。冠脉大血管和冠脉微血管系统结构或功能异常可导致心肌缺血。心外膜动脉供应心肌大部区域，冠脉微循环则为心肌提供氧气和营养物质的末端血管网，可清除心肌代谢产生的废物，具有控制炎症、修复损伤和与心肌进行体液交换的功能。不论是静息状态还是氧耗增加状态，内皮细胞在冠脉微循环血流调控中起重要作用。NO的产生和释放是内皮依赖性血管舒张的重要机制，内皮功能障碍时首先发生异常[12-14]。

内皮细胞不仅可产生一氧化氮、前列环素等，调节血管舒张，还具有抗凋亡作用。心脏的内皮细胞可通过自分泌或旁分泌NO或内皮素-1调节心肌细胞的收缩，通过调节缝隙连接蛋白-43表达促进心肌细胞同步收缩[15]。氧化应激导致内皮功能紊乱，紊乱的内皮细胞释放超氧化物、血栓素A2和内皮素等，发生一系列病理生理改变。紊乱的内皮细胞促进炎症反应及趋化因子和黏附分子表达。一氧化氮产生减少导致内皮细胞迁移和成血管能力降低，破坏血管生成与损害平衡，最终导致心肌微血管密度降低[16]。

本研究发现：LPS可通过诱发机体炎症反应，促进白细胞黏附、内皮功能紊乱[17]，导致提睾肌微循环血流速度降低。心肌梗死手术合并LPS诱导可诱发小鼠机体出现较单纯使用LPS更明显的微循环障碍。具体表现为微循环血流速度明显减慢和微循环白细胞黏附数目明显增多，而麝香通心滴丸可明显改善小鼠微循环障碍，加快微循环血流速度，减少黏附至血管内皮的白细胞数量。

本研究认为心肌梗死手术合并LPS诱发的急性缺血缺氧和炎症等病理损害除导致小鼠血管内皮细胞功能紊乱、微小血管痉挛外，还引起炎症细胞产生增多、炎症因子大量释放入血、微血栓形成增多等，导致血液流速减慢。具体病理过程可能涉及MI合并LPS激活白细胞表面TLR2(Tolllikereceptors-2)和TLR4(Tolllikereceptors-4)受体，进而白介素-12(IL-12)、B7-1(又名CD80)释放入血，最后导致黏附分子如CD11b表达增多，白细胞黏附增强及微血栓形成增加[18]。炎症分子及炎症细胞激活后导致内皮细胞功能紊乱，其合成NO能力降低，舒张血管作用下降，最终加重冠脉微循环障碍。

麝香通心滴丸通过增强提睾肌eNOS和nNOS基因表达，促进NO生成，NO具有抗活性氧簇(reactiveoxygenspecies，ROS)作用[19]，下调TLR2和TLR4受体，较少炎症因子入血，下调黏附分子如CD11b表达，最终改善内皮细胞功能、缓解微血管痉挛、改善炎症细胞功能和减少黏附于血管内皮的白细胞数量，这可能是其改善心肌梗死合并LPS双重病理因素诱发微循环障碍的可能机制[20-21]。但本研究仅从NO合成关键酶基因表达和白细胞黏附方面进行探讨，有关药物作用的具体机制仍有待深入研究。

[1]TitteringtonJS，HungOY，WengerNK，etal.Microvascularangina：anupdateondiagnosisandtreatment[J]FutureCardiol，2015，11(2)：229-242.

[2]JaarsmaC，VinkH，vanHaareJ，etal.Non-invasiveassessmentofmicrovasculardysfunctioninpatientswithmicrovascularangina[J].IntJCardiol，2017，248(1)：433-439.

[3]YongAS，HoM，ShahMG，etal.Coronarymicrocirculatoryresistanceisindependentofepicardialstenosis[J].CircCardiovascInterv，2012，5(1)：103-108.

[4]CreaF，CamiciPG.Coronarymicrovasculardysfunction：anupdate[J].NEnglJMed，2014，35(17)：1101-1111.

[5] 彭庆奎，路玮.尼可地尔联合通心络胶囊治疗冠状动脉慢血流的临床研究[J].中国实用医药，2014，9(27)：137-138.

[6] 施珊岚，张艳达，贺治青，等.麝香保心丸对心肌梗死小鼠微循环障碍的作用研究[J].中西医结合心脑血管病杂志，2017，15(5)：547-551.

[7]GunesY，TuncerM，GuntekinU，etal.Regionalfunctionsoftheleftventricleinpatientswithcoronaryslowflowandtheeffectsofnebivolol[J].TherAdvCardiovascDis，2009，3(6)：441-446.

[8]AkcayA，AcarG，KurutaE，etal.Beneficialeffectsofnebivololtreatmentonoxidativestressparametersinpatientswithslowcoronaryflow[J].TurkKardiyolDernArs，2010，38(4)：244-249.

[9]ErheG，YongHL，XiYS，etal.Anovelandefficientmodelcoronaryarteryligationandmyocardialinfarctioninthemouse[J].CirculationResearch，2010，107(12)：1445-1453.

[10]LinS，ChuJF，ZhangL，etal.ProtectiveeffectsofShexiangTongxinDroppingPillonpituitrininducedacutemyocardialischemiainrats[J].MolMedRep，2017，16(3)： 3125-3132.

[11]ChenDX，LinS，XuW，etal.QualitativeandquantitativeanalysisofthemajorconstituentsinShexiangTongxindroppingPillbyHPLC-Q-TOF-MS/MSandUPLC-QqQ-MS/MS[J].Molecules，2015，20(10)：18597-18619.

[12]OzakaziT，OtaniH，ShimazuT，etal.Reversalofinduciblenitricoxidesynthaseuncouplingunmaskstolerancetoischemia/reperfusioninjuryinthediabeticratheart[J].JMolCellCardiol，2011，50(3)：534-544.

[13]ChannonKM.Tetrahydrobiopterin：avascularredoxtargettoimproveendothelialfunction[J].CurrVascPharmacol，2012，10(6)：705-708.

[14]RoeND，RenJ.Nitricoxidesynthaseuncoupling：atherapeutictargetincardiovasculardiseases[J].VasculPharmacol，2012，57(5-6)：168-172.

[15]PriesAR，BadimonL，BugiardiniR，etal.Coronaryvascularregulation，remodelling，andcollateralization：mechanismsandclinicalimplicationsonbehalfoftheworkinggrouponcoronarypathophysiologyandmicrocirculation[J].EurHeartJ，2015，36(45)：3134-3146.

[16]PriesAR，ReglinB.Coronarymicrocirculatorypathophysiology：canweaffordittoremainablackbox[J].EurHeartJ，2017，38(7)：478-488.

[17]LiYJ，HanD，XuXS，etal.Protectiveeffectsof3，4-dihydroxyphenyllacticacidonlipopolysaccharide-inducedcerebralmicrocirculatorydisturbanceinmice[J].ClinHemorheolMicrocirc，2012，50(4)： 267-278.

[18]ElsenbergEH，HillaertMA，HesterMR，etal.Toll-LikeReceptorinducedCD11bandL-selectinresponseinpatientswithcoronaryarterydisease[J].PLoSOne，2013，8(4)：e60467.

[19]LiZ，KurtL，ChristopherAF，etal.Molecularregulationoftoll-likereceptorsinasthmaandCOPD[J].FrontPhysiol，2015，6(1)： 312.

[20]LeeMY，SunKH，ChiangCP，etal.NitricoxidesuppressesLPS-inducedinflammationinamouseasthmamodelbyattenuatingtheinteractionofIKKandHsp90[J].ExpBiolMed，2015，240(4)：498-507.

[21]LoFaroML，FoxB，WhatmoreJL，etal.Hydrogensulfideandnitricoxideinteractionsininflammation[J].NitricOxide，2014，41(1)：38-47.

ProtectiveEffectsofShexiangTongxinDroppingPillonMicrocirculationDysfunctioninMyocardialInfarctionMiceInducedbyLPSanditsMechanism

ZhangYanda，ShiShanlan，LiNa，HeZhiqing，WuZonggui，LiangChun

ShanghaiChangzhengHospital，SecondMilitaryMedicalUniversity，Shanghai200003，China.

LiangChun

ObjectiveToexploretheprotectiveeffectsofShexiangTongxindroppingpill(STDP)onmicrocirculationdysfunctioninmiceanditsmechanism.MethodsThirtymaleC57micewereused，ofwhichwererandomlydividedintoshamcontrolgroup，myocardialinfarction(MI)+lipopolysaccharides(LPS)group，andSTDPgroup.Theshamcontrolgroupmiceweregivenshamoperation.Andtheothertwogroupsweregivenmyocardialinfarctoperation.Afteroneweekofoperation，shamcontrolgroupmicewereintraperitoneallyinjectedwithNS，whiletheothertwogroupswereinjectedwithLPS.After30min，themicrocirculationflowvelocityofcremasterwasobserved.Thenthedifferentmeansofinterventionweregiventothethreegroupmice.Themicrocirculationflowvelocityatdifferenttimepointsandwhitebloodcellsadhesionwererecorded.Atlast，therelativeexpressionofendothelialnitricoxidesynthase(eNOS)andneuronalnitricoxidesynthase(nNOS)mRNAweremeasured.ResultsComparedwiththoseofshamcontrolgroup，themicrocirculationflowvelocityofMI+LPSgroupwasdecreasedsignificantly(P<0.05)andthewhitebloodcellsadheredtoendothelialcellsofMI+LPSgroupwasincreased(P<0.05).ComparedwiththoseofMI+LPSgroup，themicrocirculationflowvelocityofSTDPgroupincreasedsignificantly(P<0.05)andthewhitebloodcellsadheredtoendothelialcellsofSTDPgroupdecreased(P<0.05)，therelativeexpressionofeNOSandnNOSmRNAofSTDPgroupincreasedsignificantly(P<0.05).ConclusionSTDPcanimprovethemicrocirculationinmice.ThemoreproducedendogenousNOandthedecreasedwhitebloodcellsadheredtoendothelialcellsmightbethemechanism.

myocardialinfarction;microcirculationdysfunction;ShexiangTongxindroppingpill;lipopolysaccharides

国家自然科学基金(No.81130065，No.2014ZX09301307-016，No.81473445，No.81400336，No.91539118)；上海市科委中医引导性项目(No.15401931500)

第二军医大学附属长征医院(上海 200003)

梁春，E-mailchunliang@smmu.edu.cn

信息：张艳达，施珊岚，厉娜，等.麝香通心滴丸改善心肌梗死小鼠微循环障碍的作用机制J.中西医结合心脑血管病杂志，2017，15(23)：2969-2972.

R542.2 R289.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.23.008

1672-1349(2017)23-2969-04

2017-09-20)

(本文编辑 薛妮)