LILIC-Q/TOF对乳粉中羟脯氨酸的确证分析

（山东省食品药品检验研究院，山东济南250101）

LILIC-Q/TOF对乳粉中羟脯氨酸的确证分析

王骏，胡梅，李恒，徐大玮，薛霞，祝建华

（山东省食品药品检验研究院，山东济南250101）

建立亲水作用色谱-四极杆飞行时间质谱测定乳粉中羟脯氨酸的确证方法。乳粉样品经盐酸水解后，以HLB固相萃取柱净化，经亲水作用色谱柱分离后，使用超高效液相色谱-四极杆/飞行时间质谱分别进行全扫描和羟脯氨酸的二级质谱扫描分析，以羟脯氨酸的色谱保留时间、母离子和碎片离子的精确质量数对其进行确证分析。方法的检测限优于0.1mg/kg，可满足乳粉中非法添加羟脯氨酸的确证分析要求。

亲水作用色谱-四极杆/飞行时间质谱；乳粉；羟脯氨酸；确证分析

羟脯氨酸（Hydroxyproline，Hyp）是胶原蛋白特有的氨基酸，因其在弹性蛋白中含量极少，且在其他蛋白中不存在，常作为胶原蛋白的特征标记物。动物水解蛋白是一种廉价蛋白原料，是以牛皮及其制品的下脚料等经粗加工后制成的水解蛋白，部分不良厂商在乳粉中掺入廉价的水解动物蛋白来替代乳蛋白，以提高乳中蛋白的质量分数，降低成本。由于水解过程中添加重铬酸钾和重铬酸钠等重金属盐，具有潜在的致癌和致畸作用，早在2009年就被列入我国“第二批食品中可能违法添加的非食用物质名单”。羟脯氨酸作为这类蛋白特有的氨基酸，现已被作为非法添加动物水解蛋白的检测标记物。目前报道的羟脯氨酸的检测方法主要有：分光光度法[1-8]、离子色谱法[9]、液相色谱法[10-18]、液相色谱-质谱法[19-21]、自动氨基酸分析仪法[22-24]等。作为禁用物质标记物的检测，结果的定性尤为重要，而上述方法在结果的准确确证方面还有不同程度的欠缺，即便使用液相色谱-串联四极杆质谱检测，由于奶粉中存在母离子和子离子均相近的亮氨酸和异亮氨酸，仍可能产生假阳性结果。

液相色谱-四极杆飞行时间质谱技术近年来日趋成熟，通过飞行时间质谱测定目标物和其碎片离子的精确质量数，对目标物进行定性，有助于排除假阳性结果，实现对禁用物质的确证分析。本文建立超高效液相色谱-四极杆/飞行时间质谱确证检测乳粉中羟脯氨酸的方法，对经氯胺-T分光光度法检测羟脯氨酸为阳性的乳粉样品进行了确证分析，结果表明方法准确可靠。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器与条件

Acquity UPLC超高效液相色谱仪：美国Waters公司，由二元泵、柱温箱、自动进样器组成；Acquity UPLC BEH HILIC 色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）：Waters公司；流动相A为乙腈，流动相B为10 mmol/L乙酸铵水溶液，梯度洗脱程序为0～4min，由85%A线性变化至75%A；4min～6min线性变化至60%A，6min～8min线性变化至85%A，流速为0.4mL/min；柱温40℃；进样量为10 μL。

XEVO QTOF型四极杆飞行时间质谱仪：美国Waters公司，配电喷雾电离源（ESI），带有Masslynx 4.1和Targelynx软件。操作参数为：电喷雾电离源正离子模式，毛细管电压3.5 kV，锥孔电压18 V，提取锥孔电压4 V；源温135℃，脱溶剂气温度450℃，脱溶剂气流量800 L/h，锥孔气流量50 L/h。分别采用MSE和MS/MS两种扫描模式，MSE采集模式：低能通道碰撞能量为6 eV，高能通道碰撞能量为10 eV～30 eV，质量扫描范围 50 amu～600 amu；MS/MS采集模式：Q1设定为单位质量分辨，母离子质量数为132.06，碰撞能量为18 eV，二级质谱扫描范围50 amu～600 amu。采用200 pg/μL亮氨酸-脑啡肽溶液进行实时质量校正（Lockmass），参比质量为556.277 1 amu。

1.1.2 试剂和材料

羟脯氨酸标样：中国国家标准物质中心；乙腈（色谱纯）：美国 Fisher公司；乙酸铵（纯度＞99%）：美国Sigma公司；盐酸（优级纯）、苯酚（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；试验用水为Mili-Q超纯水机（美国Millipore公司）现制备；HLB固相萃取柱：200mg/6mL，美国Waters公司；0.22 μm有机相微孔滤膜：天津津滕公司；全脂乳粉6批，婴幼儿配方乳粉5批：分别购自济南、青岛的超市。

1.2 样品处理

称取0.5 g乳粉样品，精确至0.000 1 g，至20mL水解管中，加入5.00mL浓盐酸（优级纯），滴加3滴50 g/L苯酚水溶液（新蒸馏的苯酚），充氮2min，封口，在110℃水解24 h，取出冷却，同时做空白试验。打开水解管，经滤纸过滤到100mL容量瓶中，用超纯水反复冲洗滤纸和漏斗，定容、摇匀。

取一支HLB固相萃取柱，先用3mL甲醇、3mL水活化，取水解液5mL上样，弃去最初的2mL，收集3mL流出液于15mL离心管中，置于氮吹仪上氮吹15min，取 50 μL，加入 950 μL 乙腈混匀，经 0.22 μm有机相微孔滤膜过滤后待测。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理方法

乳粉样品的水解采用了通用的氨基酸水解条件，考虑到要采用亲水色谱分离、质谱检测进行确证，还需进一步对样品水解液进行净化和处理。乳粉水解液为强酸性溶液，而且含有未充分水解的成分，在进行液质分析前，需去除这些干扰。羟脯氨酸在水解液中为阳离子，具有较强的极性，采用HLB固相萃取柱净化时，会直接穿过净化柱，而其余大分子的、极性较弱的组分则会被吸附在HLB柱中，实现羟脯氨酸与干扰组分的分离。因此本试验采用直接穿透法，取一部分过HLB柱的水解液，再进行氮气吹扫赶酸，使水解液中的盐酸大部分挥发，最后以乙腈稀释、定容。经过这样的处理步骤，羟脯氨酸水解液得到一定程度的净化，大量的盐酸被除去，最终进样的溶液也调整到适合亲水色谱测定的组成，可以获得较为理想的结果。

2.2 液相色谱条件的优化

由于羟脯氨酸的极性很强，在反相色谱柱上无法保留，难以与其他极性组分分离，无法避免整数质量相同的亮氨酸、异亮氨酸等组分的干扰，即使使用高分辨质谱也会因极强的基质效应无法分辨。羟脯氨酸具有氨基酸典型的两性特征，在酸性介质中呈阳离子，适合使用亲水作用色谱保留和分离。本试验选用了Wa ters公司的Acquity UPLC BEH HILIC色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7μm）做为分析柱，以乙腈和10 mmol/L乙酸铵溶液为流动相，进行梯度洗脱，结果表明羟脯氨酸峰形对称，分析时间短，包括系统平衡在内，仅需6min即可完成一个样品的确证分析，羟脯氨酸提取离子流图见图1。

2.3 质谱参数的优化

图1 标样（A）和阳性（B）样品中的羟脯氨酸提取离子色谱图Fig.1 Extracted ion chromatogram for hydroxyproline of Standard sample（A）and positive sample（B）

将100 ng/mL的羟脯氨酸标样溶液注入质谱仪，对质谱参数进行优化，以获得最佳的灵敏度，同时采集确认羟脯氨酸的子离子信息。锥孔电压和碰撞能量是质谱参数中最重要的两个。锥孔电压直接影响目标物的灵敏度，随着锥孔电压的升高，目标物响应值逐渐增强，但锥孔电压过高可能导致羟脯氨酸分子离子在离子源内发生碰撞解离，反而影响母离子的灵敏度。经试验，在锥孔电压18 V、碰撞能量为6 eV时，可获得羟脯氨酸最强的准分子离子峰。为得到更多的碎片离子，增强方法的可靠性，同时又不希望损失其准分子离子的灵敏度，采用了MSE的采集模式，即同时采集2个不同碰撞能量通道的数据，低能通道监测准分子离子，高能通道采集碎片离子的信息，相应的质谱图见图2、图3。

图2 低碰撞能量通道下获得的羟脯氨酸质谱图Fig.2 Mass spectrogram of hydroxyproline with a low collision energy

图3 高碰撞能量通道下获得的羟脯氨酸质谱图Fig.3 Mass spectrogram of hydroxyproline with a high collision energy

经试验优化，低能通道碰撞能量为6 eV，高能通道碰撞能量为10 eV～30 eV为较理想的条件。

2.4 高分辨质谱精确质量测定在羟脯氨酸确证中的优势

很多婴幼儿配方奶粉中添加了亮氨酸和异亮氨酸，它们与羟脯氨酸在电喷雾质谱中的母离子和子离子见表1。

表1 羟脯氨酸与亮氨酸、异亮氨酸监测离子精确质量数Table 1 Exact mass for the monitoring ions of hydroxyproline，leucine and isoleucine

表1数据分析可知，亮氨酸、异亮氨酸的母离子、子离子完全相同，虽与羟脯氨酸的母离子、子离子化学组成不同，但精确质量数相差均在0.05 amu以内，在单位质量分辨的四级杆等低分辨质谱[1，14，22]中无法区分，即便两个子离子的相对丰度比与羟脯氨酸不一致，也不能完全排除假阳性的结果，无法实现对结果的确证。

本研究建立了基于高分辨质谱的方法，对母离子和子离子质量测定的精度均可达2ppm以内，在羟脯氨酸的质量数上，能区分不超过0.000 3 amu的质量差异，因此可以轻松识别羟脯氨酸与亮氨酸、异亮氨酸，从而实现对羟脯氨酸检测结果的准确确证。

2.5 线性范围和检出限

在确定的试验条件下，用阴性奶粉试样制备空白基质提取液，配制系列不同浓度（0.005μg/mL～2μg/mL）的羟脯氨酸标准溶液进行测定，以各组分的峰面积（y）对其浓度（x，μg/mL）绘制标准曲线，线性方程为y=1 368.21x+38.2，相关系数（r）为 0.985，表明羟脯氨酸在0.005μg/mL～2μg/mL 浓度范围内具有较好的线性关系。在空白奶粉中添加不同水平的羟脯氨酸混合标准溶液，按照本方法进行处理，当添加量为0.1mg/kg时羟脯氨酸仍可准确定性，低于此水平时，由于碎片离子[M-CO3H4]+质谱信号强度不足，因此将本方法的最低检测限定为0.1mg/kg。由于添加羟脯氨酸的标样进行回收率测定不能反映胶原蛋白水解的过程，考虑到本方法为定性确证的方法，所以没有进行加标回收的试验。

2.6 方法的应用

应用本方法测定了全脂乳粉、婴幼儿配方乳粉等疑似阳性样品11批，其中6批样本经确证结果为阳性，结果见表2，阳性样品谱图见图4。

表2 全脂乳粉、婴幼儿配方乳粉样品确证结果Table 2

图4 MS/MS模式得到的阳性样品中羟脯氨酸母离子和子离子提取色谱图Fig.4 Extracted ion chromatogram for hydroxyproline of positive sample with MS/MS mode

进一步分析样品的配料并与生产商确认，这些产品中添加了深海鱼胶原蛋白，检出羟脯氨酸为合理结果，这也进一步表明本方法对结果的确证准确可靠。

3 结论

研究结果表明，超高效液相色谱-四极杆/飞行时间质谱测定乳粉中羟脯氨酸的方法具有操作简单、分离效率高、定性确证准确可靠等显著特点，是一种对乳粉中羟脯氨酸疑似结果进行准确确证的有效技术。

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Confirmatory Analysis of Hydroxyproline in Milk Powder by LILIC-Q/TOF

WANG Jun，HU Mei，LI Heng，XU Da-wei，XUE Xia，ZHU Jian-hua
（Shandong Institute for Food and Drug Control，Jinan 250101，Shandong，China）

A confirmatory analytical method was developed for the determination of hydroxyproline in milk powder using hydrophilic interaction chromatography coupled with quadrupole-time of flight-mass spectrometry（HILIC-Q/TOF）.The samples were hydrolyzed with hydrochloric acid，and cleaned up by solid phase extraction，and the protein was precipitated with acetonitrile subsequently.After separated on an Acquity UPLC BEH HILIC column，hydroxyproline was carried out in the full scan and daughter ion scan mode.The hydroxyproline was confirmed by the retention time，accurate mass of parent ion and fragment ions，and the detection limit was better than 0.1mg/kg.The method was suitable for the confirmation of hydroxyproline in milk powder．

HILIC-Q/TOF（Hydrophilic interaction chromatography coupled with quadrupole-time of flightmass spectrometry）；milk powder；hydroxyproline；confirmatory analysis

王骏，胡梅，李恒，等.LILIC-Q/TOF对乳粉中羟脯氨酸的确证分析[J].食品研究与开发，2018，39（1）：113-117

WANG Jun，HU Mei，LI Heng，et al.Confirmatory Analysis of Hydroxyproline in Milk Powder by LILIC-Q/TOF[J].Food Research and Development，2018，39（1）：113-117

10.3969/j.issn.1005-6521.2018.01.022

山东省重点研发计划项目（2015GSF120018）

王骏（1972—），男（汉），研究员，学士，研究方向：食品安全分析及风险预警。

2017-03-14