扣囊复膜酵母在酿酒中的应用研究进展

苏畅，马莹莹，杨建刚

（四川理工学院生物工程学院，四川自贡643000）

扣囊复膜酵母在酿酒中的应用研究进展

苏畅，马莹莹，杨建刚*

（四川理工学院生物工程学院，四川自贡643000）

扣囊复膜酵母属于酵母菌的一种，又称扣囊复膜孢酵母，扣囊拟内孢霉。大量研究发现扣囊复膜酵母广泛存在于各种酒曲中，能产淀粉酶，酸性蛋白酶，β-葡萄糖苷酶，且其所产的酶都具有较高的活性；除此之外，不少研究发现扣囊复膜酵母还具有一定的产香产酯以及可利用丢糟生产单细胞蛋白饲料的能力。在酿酒工业中，这些酶活性决定了扣囊复膜酵母能够以各种原料为底物，进行发酵产酒精；其产香产酯能力又在不同程度条件下增加酒的香气，丰富了酒的风味，又可利用丢糟生产蛋白饲料能力，开辟了白酒酒糟的处理及利用途径。这些决定了扣囊复膜酵母在酿酒工业中有极大的研究价值和发展潜力，因而备受关注。综述扣囊复膜酵母的生理生化特性，菌种的选育，产酶、产香产酯特性，以及在处理丢糟方面的一些应用，以期为扣囊复膜酵母在酿酒工业上的合理利用，提供新的思路和方法。

扣囊复膜酵母；菌种选育；酶特性；产香功能；酒糟蛋白饲料

扣囊复膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera），又称扣囊复膜孢酵母，扣囊拟内孢霉（Endomycopsis fibuligera），是子囊菌属的一个种，具有完全世代，可形成酵母菌样出芽细胞及菌丝状细胞。通过多极出芽和菌丝体形成来增殖，其子囊是球状的，游离于体细胞或附着于菌丝尾部或壁上。每个子囊能形成两个到四个帽状子囊孢子，成熟时释放[1]。Wikerham等第一次报道扣囊复膜酵母能够水解淀粉[2]，瑞典Symba酵母工艺（Swedish Symba yeast process）使用的主要酵母就是这种酵母菌。由于扣囊复膜酵母可以分泌淀粉酶、酸性蛋白酶、和β-葡萄糖苷酶，故它能利用葡萄糖、蔗糖、纤维二糖、海藻糖和可溶性淀粉，它同时也可以和酿酒酵母及运动单胞发酵菌属混合起来利用木薯淀粉生产酒精[3]，在一些研究报告中，扣囊复膜酵母除了具有较强的糖化能力和产蛋白酶能力，它还具有一定的产酯能力[4]，因而它在酿酒工业中具有重要地位，也是近年来发酵行业研究的热点。

1 扣囊复膜酵母在酒曲中分离研究进展

酒曲是谷物及其辅料经蒸煮后接种或自然接种定型发酵而成、用于白酒酿造的糖化发酵剂。酒曲中含有多种微生物及其产生的复杂酶系，在中国白酒酿造中起着糖化、发酵、生香的作用[5]。扣囊复膜酵母广泛存在于各种酒曲，但目前国内酿酒行业对其研究较少，对扣囊复膜酵母的研究主要集中在黄酒、米酒等酿造酒领域及清香型白酒中，在这些研究中扣囊复膜酵母在酒曲中的真菌菌群中多以优势菌的形式展现，在浓香型白酒酒曲和酱香酒曲中也常常能分离得到一定量的扣囊复膜酵母[6-10]。

胡佳音等采用传统分离方法结合高通量测序对清香、酱香、浓香3种大曲真菌进行多样性分析，两种方法所获得结果较为一致。研究表明，清香型大曲真菌主体较为明显，扣囊复膜酵母和伞枝横梗霉是绝对主体，占94%，其中所分离的扣囊复膜酵母数量为340×104cfu/g，而生香酵母和酿酒酵母数量较少。而浓香型大曲中所分离的扣囊复膜酵母，数量为6×102cfu/g，相对清香型大曲所分离的扣囊复膜酵母来说，数量较少。浓香型大曲和酱香型大曲多样性结果较为接近，两种大曲中较难分离到酵母类真菌，其主体菌均为谢瓦散囊菌；区别在于，浓香型大曲中真菌种类较多，数量较为接近，而酱香型大曲中，真菌多为耐热丝状真菌和青霉菌[11]。在以汾酒为代表的清香型白酒研究中，马凯、崔哲男等从汾酒大曲曲房曲堆中随机取上、中、下取3份大曲样品。分离出81株真菌，并对这81株菌进行了基于ITS基因序列的分子生物学鉴定。结果表明，在汾酒大曲中分布有6个属的霉菌和4个属的酵母菌，其中扣囊腹膜孢酵母是优势酵母菌种，伞枝犁头霉和匍枝根霉是优势霉菌菌种[12]。推断清香型大曲中扣囊覆膜酵母在清香型大曲酒发酵过程有着重要的作用。糯米酒是中国特色的传统酿造酒，在其酿造过程中酒曲起关键作用。传统酒曲的微生物数量及种类难以控制，造成酒曲质量不稳定。应玲云等，将该酒曲稀释涂布在淀粉培养基（YPS）平板上培养，得到1株产淀粉酶酵母菌。通过形态学、生理生化特征和ITS区序列分析鉴定为扣囊复膜酵母，随后应玲云等将该扣囊复膜酵母在YPS液体培养基中28℃培养4 d，用Yoo改良法测得其粗酶液的淀粉酶活力为49.8 U/mL。随后运用该酵母菌进行产酒精实验，使其在糯米糖化液（含175 g/L葡萄糖）中28℃发酵3 d，测得酒精度为5.63%（v/v）。发现该扣囊复膜酵母既能同化淀粉又能发酵产生酒精，具有用于纯菌种酿造糯米酒的潜力[13]。我国有五千多年的黄酒酿造历史，已经形成诸多风格独特的黄酒品牌，但是能够代表中国黄酒总体特色的只有绍兴黄酒[14]。酒药或称小曲、白药、酒饼，是以籼米粉、辣蓼草等为主要原料制作而成，兼具有糖化和发酵的双边作用，是我国独特的酿酒用糖化发酵剂[15]。比较有代表性的酒药，包括绍兴酒药、宁波酒药、苏州甜酒药、上海崇明“八二曲”、常州曲药等[16]。在我国南方地区，以酒药做糖化发酵剂来酿制黄酒和小曲白酒十分普遍，酒药内也蕴含着丰富的酿酒微生物资源[17]。臧威，谢广发等从绍兴地区5个主要黄酒生产企业，采集古越龙山、会稽山、塔牌、沈永和、女儿红及鉴湖6个品牌酒药样本，在数量、种类和分布规律等方面对黄酒酒药内酵母菌物种资源进行了系统研究，遵循酵母菌分类原则，从绍兴黄酒酒药中分离鉴定出3种酵母菌，扣囊复膜孢酵母、酿酒酵母和隐球酵母。其中，扣囊复膜孢酵母在6个品牌黄酒酒药内的分布占有绝对优势，该种酵母菌可能对绍兴黄酒酒药的生产性能来说至关重要。并且推测出扣囊复膜孢酵母在绍兴黄酒酿造过程中的重要性并不在于转化糖类物质形成酒精的能力，而是参与糯米等酿酒原料中淀粉等大分子物质糖化水解过程并发挥重要作用[18]。

2 扣囊复膜酵母产酶特性

2.1 扣囊复膜酵母产β糖苷酶特性

β-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.21），其英文名为 β-glucosidase，亦称纤维二糖酶，其能水解纤维二糖和短链的纤维寡糖生成葡萄糖。在纤维素酶水解纤维素的过程中，β-葡萄糖苷酶可以水解纤维二糖从而释放出葡萄糖成为关键的一步。在纤维素降解、食品风味的改善等领域具有重要的应用价值。在酿酒工业中，大曲原料中大麦和豌豆含有大量的纤维素，酵母对其利用率不高，而扣囊复膜孢酵母与酿酒酵母的协同作用，能够提高纤维素的利用率，提高酒精的产量[19]。

张梁、周衍等用潮霉素B选择性标记的pRS41H质粒为载体。在工业酿酒酵母自身的gpd2启动子、终止子下，使扣囊复膜孢酵母的β-葡萄糖苷酶（BGL基因）在工业酿酒酵母中进行表达。在潮霉素B500μg/mL的培养基上挑选、得到重组子S．cerevisiae BGL，可以在以纤维二糖为唯一碳源的培养基上生长，并且36 h时。测得最高酶活为8.18 U/mL。在纤维二糖为唯一碳源的酒精发酵中，发酵12 h时酒精度达到0.015%[20]。Makoto Machida，Isao Ohtsuki等从扣囊复膜酵母中分离出两种β-葡萄糖苷酶，即BGL1和BGL2两个基因，分别将BGL1和BGL2导入酿酒酵母中在以纤维二糖为底物的条件下进行发酵，发现含有BGL1基因的酿酒酵母能够有效水解纤维二糖且能发酵生成乙醇，而含有BGL2基因的酿酒酵母却不能[21]。红薯渣是红薯加工过程的残渣，干物质中蛋白含量低，纤维含量高。如果能将红薯渣进行有效利用，将其用来产蛋白，将是一举两得的事情。安文亭、刘树栋等以红薯渣为原料，以酵母茵、霉菌、植物乳杆菌、酸菌芽孢杆菌作为发酵菌种，研究不同菌种混菌组合发酵红薯渣对薯渣营养价值的影响。结果表明，发酵红薯渣的适宜三菌、四菌组合分别为枯草芽孢杆菌+扣囊酵母+黑曲霉和枯草芽孢杆菌+扣囊复膜酵母+绿霉菌+植物乳杆菌。三菌发酵中枯草芽孢杆菌+扣囊复膜酵母+黑曲霉所得到发酵产物真蛋白总量提高了33.17%，粗纤维总量降低了21.03%。四菌发酵中枯草芽孢杆菌+扣囊复膜酵母+植物乳杆菌+绿霉菌发酵产物真蛋白总量提高了44.30%，粗纤维总量降低了26.60%[22]。

以上研究表明，扣囊复膜酵母产β-葡萄糖苷酶具有高酶活，能够将其运用在酿酒行业，能将高分子纤维二糖水解成可用来的发酵的葡萄糖，酿酒原料得以充分利用，避免了原料的浪费。此外，有研究表明β-葡萄糖苷酶能将葡萄中的非挥发性糖苷转化成挥发性的香气物质，提高葡萄酒香气复杂性，改善葡萄酒质量[23-24]。所以，如果能将扣囊复膜酵母产高酶活的β-葡萄糖苷酶这一特性，将其运用到葡萄酒酿造行业，能够起到丰富葡萄酒香味成分的作用。

2.2 扣囊复膜酵母产淀粉酶的特性

淀粉酶是指能将淀粉水解成各种低分子糖的酶的总称，是一种应用极广的酶类。扣囊复膜酵母具有很强的产淀粉酶的能力，可以高效的利用淀粉质原料，是酒曲微生物的重要组成部分，众多科技工作者都对此进行了广泛而深入的研究。所以选育出产淀粉酶的高酶活的菌株，进行发酵产酒条件优化或构建能直接利用淀粉的酿酒酵母工程菌都具有特殊的重要意义。

自然选育出的高淀粉酶活酵母菌株与工业菌株比较，具有专一性酿造的优势。陈蕾对实验室已筛选的一株高淀粉酶活扣囊复膜酵母进行发酵条件优化，并且通过表面相应法对固体发酵条件进行优化设计，得到最终优化条件为湿度61.5%（v/v），底物配比（稻壳：麦麸）0.42，淀粉2.0%（w/w），接种量为 2.0%，28℃培养，天然pH；在最优条件下，该扣囊复膜酵母在固体发酵淀粉酶的酶活力在120 h内达到了4 296 U/g，在此基础上，利用该菌株与一株酿酒酵母进行发酵，发酵结束后测得酒精度达到了10.5%（v/v）[25]。庾昌文，薛栋升等从清香型小曲酒醅中分离得到高产淀粉酶酵母，由形态及5.8S-ITS rDNA片段序列分析鉴定为复膜孢酵母属扣囊复膜孢酵母。发现该菌在基础发酵培养基中，菌株生长与产酶具有同步性，48 h内产酶活达到101 U/mL。优化后的培养条件为：接种量为5%，培养温度为32℃，培养基起始pH值为7，装液量为50mL。采用此发酵条件产酶活力可达到118 U/mL，较初始条件提高了16.83%[26]。酿酒酵母不能水解淀粉和糊精，利用扣囊复膜酵母的α-淀粉酶基因在酿酒酵母中表达显得非常重要，这样构建的重组酒精酵母菌可以利用淀粉为底物一步发酵生产乙醇，这样就避免了生产和使用商品酶，同时原料的利用率得到很大提高，可为企业减少大量成本，同时可分解淀粉的遗传重组工程菌是安全可靠的，适合于工业生产。张峰、王肇悦等用同源重组的方式，将由PGK1启动子、酵母α-因子信号序列，以及扣囊复膜酵母的α-淀粉酶基因编码区组成的基因表达盒整合到啤酒酵母工业菌株基因组的ILV2位点，使得该啤酒酵母工业菌株在获得分泌表达α-淀粉高酶活性的同时，具有较低AHAS活性的特征，并且该菌株发酵液中双乙酰含量也有所降低，所构建的工程菌生物安全性相对较高，具有较高的理论意义和实际应用价值[27]。

2.3 扣复膜酵母产酸性蛋白酶的研究进展

在酿酒业中应用酒用酸性蛋白酶，可在白酒酿造的发酵过程中起协同作用，具有溶解发酵原料、促进微生物繁殖、分解蛋白质生成香味物质、降解酵母菌体蛋白等多种功能，以提高酒的产量和质量，并愈来愈受到人们的重视[28]。目前已发现能分泌酸性蛋白酶的微生物主要是霉菌[29]。扣囊复膜酵母因又称扣囊拟内孢霉，具有一定霉菌的特性，在一些研究中发现它能产酸性蛋白酶。山下一郎早在1986年就将扣囊复膜酵母可分泌酸性蛋白酶的基因PEPI克隆，并使其在酿酒酵母中得以表达[30]。于欣君等将编码由扣囊复膜酵母天然产生的酸性蛋白酶的基因（SFAP1）克隆并在解脂耶氏酵母中超表达，产生大量酸性蛋白酶可以使脱脂牛奶凝固，也可以使虾壳脱蛋白。纯化的酸性蛋白酶的最佳pH值和温度分别为3.5和33℃，并且该酶在1.0±3.0的pH值范围内非常稳定[31]。

3 酿酒中扣囊复膜酵母对酒风味物质的影响

酯类是一类具有芳香性气味的化合物，多数呈现果香，是白酒中重要的芳香物质，具有呈香作用，可以在不同程度上增加酒的香气，并可决定香气的品质，尤其对白酒香型的归属起到重要作用[32]，产香酵母又称为产酯酵母,主要属于产酯酵母和假丝酵母,它是中国白酒中酯香的主要产生菌[33]。

产香酵母能够以乙醇为碳源,既具备乙醇发酵能力又具备醋酸发酵能力,能够产生以酯香为主的多种香味物质。其可以以糖、醛、有机酸、盐类为养料,在酯酶作用下合成酯类[34]。生香酵母适用于各种酒的生产,其主要作用是产酯增香,除杂味,改善酒的品质。扣囊复膜酵母具有一定的产香产酯的能力。

和东芹等在枣酒的研制过程中，发现一株适于枣酒酿造的优良酵母茵E9802。该菌株酿制的枣酒具有浓郁的枣香，且酒体丰满、口感醇和、醇厚。根据其形态、菌丝、繁殖方式、子囊孢子、对淀粉分解及生理生化等几方面的性能特征，鉴定此菌株为扣囊复膜酵母，并且发现将该菌株酿制的枣酒与其他菌株酿制枣酒对比，发现该扣囊复膜酵母酿制的枣酒中乙酸乙酯的含量明显高于其他酵母所酿制的枣酒，并且其他酯含量也相对较高[35]。王琨等为改善液态法酿造糯米酒口感淡寡的缺点，在传统法酿造的基础上，采取顺序接种，即先接种米根霉8-3M进行液化糖化，然后将扣囊复膜酵母菌株3-1Y与YWl2按比例接种以增加酒体芳香类物质种类及量，最后接种酿酒酵母SJ4糯米酒发酵。采用气相色谱技术对糯米酒样品的风味物质进行检测，并对挥发性化合物进行主成分分析。结果表明：当选定酿酒酵母SJ4的接种量为每克糯米接种1×106个细胞，扣囊复膜酵母菌株3-1Y与YWl2的接种比例为3：7（接种量为每克糯米接种1×106细胞）所得到的风味物质含量最优，感官评分最高[36]。罗小叶等采用可培养方法对酱香大曲酵母进行分离、鉴定，共筛选出12株酵母，用高粱培养基对酵母的产香功能进行初筛，通过感官评定确定1株主要产果香味的酵母菌株，被筛选出的酵母经形态学观察、生理生化实验及ITS基因序列分析鉴定，确定为扣囊复膜酵母。对产香酵母风味成分进行气相色谱-质谱联用仪检测分析。结果表明，醇类物质相对百分含量提高了51.87%，包括乙醇、异丁醇、异戊醇、苯乙醇等，这些醇类物质共同赋予发酵产物果香味；酯类物质相对百分含量提高了41.39%，包括乙酸乙酯、乙酸异戊酯呈现清灵果香，其他产物如丁酸乙酯、2-甲基丁基乙酸酯、丙酸正戊酯、辛酸乙酯、十六酸乙酯等也在不同程度上呈现出果香味；还检测到少量的酚类、酮类、醛类、烷烃类以及少量未定成分的物质[37]。王小丹、陈美竹等采用可培养方法对酱香型白酒大曲中的酵母菌进行计数和筛选，通过形态学特征，生理生化实验及酵母ITS基因序列分析的分子生物学方法鉴定酵母，并分析酵母的发酵能力和风味成分。结果发现编号FBKL2.0071扣囊复膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）固态发酵物具有浓郁的果香味，其中以乙酸乙酯、乙酸异戊酯、苯乙醇、乙酸苯乙酯、棕榈酸乙酯含量较高[38]。然酿造的白酒经产酯酵母自身合成的风味物质比添加化学物质更多样，风味更加丰富独特，因此越来越多的白酒也用产香酵母增香，使酒体酒质有更大的提高[39]。

4 扣囊复膜酵母在丢糟处理上的应用

白酒丢糟是以高粱、小麦、玉米、谷物等为原料经过固态发酵、蒸馏提取酒精后的残留物。据统计，我国白酒酿造行业每年产生约2 500万t的丢糟[40]，白酒丢糟酸度大，水分含量在65%以上，极易腐败且不易贮存，若随意丢弃或焚烧，会对环境造成严重污染[41]。另一方面，白酒丢糟中残存着未能完全利用的淀粉、富集的蛋白质、代谢产物氨基酸、维生素、矿物元素、纤维素、无氮浸出物和微生物残体等营养物质[42]，若能将其及时有效的综合利用，既解决了环境污染的问题，又可以节约粮食、降低生产成本，进而取得显著的社会经济效益。扣囊复膜酵母可以用来发酵糟醅，制备菌体蛋白饲料。祖国仁等为了研究扣囊复膜酵母和产朊假丝酵母混合菌体发酵白酒糟醅的最佳培养条件，发现采用同时接种方式，菌种混合比1∶1，培养温度30℃，培养基起始pH5,培养时间6 d下发酵产物每克干基酵母细胞数达到24.28亿个，粗蛋白含量3.54%,比原料白酒糟粗蛋白含量2.76%提高了47.36%，总糖6.23%，比原料白酒糟总糖含量10.64%，降低了41.45%[43]。卢向阳等以优良菌种117号产朊假丝酵母、136号热带假丝酵母、白地霉和扣囊拟内孢霉混合发酵酒糟，生产酒糟单细胞蛋白饲料，他们在发酵前用适量糖化酶预处理酒糟能明显提高酒糟蛋白质含量，人和成年哺乳动物必需氨基酸及钙和磷含量明显增加。发酵最佳培养基为80%酒糟，15%麦麸，3%玉米粉，1%豆饼，1%尿素，0.05%磷酸二氢钾，最适发酵起始pH为5.0左右[44]。

5 结语

扣囊复膜酵母的高糖化力与高蛋白酶活性以及产酯能力决定了其在制酒工业有巨大的作用，但是国内对于扣囊复膜酵母在酿酒工业的运用还较少，国内对于扣囊复膜酵母的研究主要还是体现在它可高产海藻糖的特性，所以可以尝试从以下几方面对扣囊复膜酵母进行改进：

1）扣囊复膜酵母能利用丢糟生产单细胞饲料蛋白等营养物质，可以考虑将其具有营养物质的丢糟再配合一定的糟醅进行新一轮的发酵，或者配以串蒸工艺，使其营养物质能充分利用。

2）在深入研究扣囊复膜酵母和其他菌株特性的基础上，利用它们的互利关系，取长补短，发挥各自的优势进行有规律的混合发酵，生产出成本更低，质量更优异的产品将会具有很大的市场空间。

3）由于扣囊复膜酵母产生的淀粉酶具有水解生淀粉的能力，可以考虑利用扣囊复膜酵母进行生料发酵，这将对降低企业的生产成本很有帮助。

4）由于扣囊复膜酵母具有产香产酯能力，而川法小曲白酒由于采用纯种根霉加酵母作为糖化发酵剂，难免会有口味寡淡的缺点，如果能将扣囊复膜酵母产香产酯的特性运用于川法小曲酒的酿造中，将会对整个酒质有一个提高与改善。

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Research Progress of Saccharomycopsis fibuligera in Liquor-making Industry

SU Chang，MA Ying-ying，YANG Jian-gang*
（College of Bioengineering，Sichuan University of Science and Engineering，Zigong 643000，Sichuan，China）

Saccharomycopsis fibuligera belongs to yeast，also known as sac buckle Saccharomycopsis，endomycopsis fibuligera；widely exists in all kinds of yeast，can produce amylase，acid protease in the fermentation industry，beta glucosidase，and its production of enzyme had high activity，in addition the study found that，a lot of Saccharomycopsis fibuligera also has certain aroma producing ester production as well as the use of distiller's ability to produce high quality and low cost of grains of single cell protein feed.In the wine industry in the activity of these enzymes determines Saccharomycopsis fibuligera by all kinds of raw materials as substrates，fermentation of alcohol；the aroma producing ability and increase alcohol ester production in different degree under the condition of aroma，rich flavor of wine.At the same time and it can use distiller's grain production of protein feed，the ability to determine Saccharomycopsis fibuligera has research value and great potential in the brewing industry，this paper summarizes the physiological and biochemical characteristics of Saccharomycopsis fibuligera，strain breeding，application of enzyme producing and aroma producing characteristics and yield of ester producing lees protein feed，provide new ideas and methods for the rational use of Saccharomycopsis fibuligera in the brewing industry.

Saccharomycopsis fibuligera；strain selection；enzyme characteristics；aroma function；distillery protein feed

苏畅，马莹莹，杨建刚.扣囊复膜酵母在酿酒中的应用研究进展[J].食品研究与开发，2018，39（1）：205-209，220

SU Chang，MA Yingying，YANG Jiangang.Research Progress of Saccharomycopsis fibuligera in Liquor-making Industry[J].Food Research and Development，2018，39（1）：205-209，220

10.3969/j.issn.1005-6521.2018.01.040

四川省省属高校科研创新团队建设计划项目（16TD0026）；固态酿造研究四川省院士（专家）工作站（GY2015-03）

苏畅（1993—），男（汉），硕士研究生，研究方向：发酵工程。

*通信作者：杨建刚（1961—），男（汉），教授，研究方向：酿酒生物技术及应用。

2017-05-15