USP22蛋白在甲状腺乳头状癌中的表达及临床意义

罗铮铮，杨小敏

(1.惠州市中心人民医院耳鼻咽喉头颈外科，广东 惠州 516001；2.惠州市第一人民医院耳鼻咽喉头颈外科，广东 惠州 516001)

USP22蛋白在甲状腺乳头状癌中的表达及临床意义

罗铮铮1，杨小敏2

(1.惠州市中心人民医院耳鼻咽喉头颈外科，广东 惠州 516001；2.惠州市第一人民医院耳鼻咽喉头颈外科，广东 惠州 516001)

目的探讨泛素化特异性蛋白酶22(USP22)在甲状腺乳头状癌、甲状腺腺瘤和结节性甲状腺肿中的表达情况，分析其与临床病理参数的关系。方法应用免疫组织化学方法检测惠州市中心人民医院2010-2015年收治的10例结节性甲状腺肿、20例甲状腺腺瘤和60例甲状腺乳头状癌组织中USP22蛋白的表达，分析其与性别、年龄、肿物大小、多灶性、包膜浸润和Ⅵ区淋巴结转移等临床病理特征的关系。结果USP22在甲状腺乳头状癌组织中的表达高于甲状腺腺瘤组织及结节性甲状腺肿组织，差异有统计学意义(P＜0.05)；USP22的表达与Ⅵ区淋巴结转移和肿瘤大小有关(P＜0.05)，而与性别、年龄、多灶性、包膜浸润等特征无关(P＞0.05)。结论与结节性甲状腺肿和甲状腺腺瘤相比，USP22在甲状腺乳头状癌组织细胞中高表达，其高表达与肿瘤大小和Ⅵ区淋巴结转移有关。USP22蛋白可能是一种新的预测甲状腺乳头状癌预后的肿瘤标记物以及生物治疗靶点。

甲状腺乳头状癌；泛素化特异性蛋白酶22；Ⅵ区淋巴结转移；免疫组织化学

甲状腺癌(thyroid carcinoma)是内分泌系统最常见的恶性肿瘤，在头颈部恶性肿瘤中占5.11%[1]，在北美，甲状腺癌的发病率以每年超过6%的速度增长，已成为女性恶性肿瘤的第5位[2]。超过90%的甲状腺癌为分化型甲状腺癌(differentiated thyroid carcinoma，DTC)，主要包括甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)和甲状腺滤泡状癌(follicular thyroid carcinoma，FTC)，临床上以 PTC 最为常见，约占 70%[3]。随着分子生物学的不断发展，与甲状腺癌有关的基因突变分子靶点及相关信号转导通路正逐渐被人们所认识，这有助于评估甲状腺癌的恶性程度、侵袭性和转移风险，以及决定手术切除范围、Ⅵ区淋巴结的处理等，针对相关异常信号通路和基因突变设计的生物靶向治疗正成为一种新的治疗甲状腺癌的方法。泛素化特异性蛋白酶22(ubiquitin specific protease 22，USP22)是近年来新发现的肿瘤标记物，能够通过去除泛素连接蛋白底物上的泛素调控泛素化的过程，参与细胞内多种蛋白的降解，调控一系列细胞内活动如生长、分化、细胞周期调控、肿瘤的形成、抗原呈递、转录调控及信号转导等[4]。国内外相关报道已发现，USP22在喉癌、肺癌、口腔鳞癌等多种肿瘤细胞中高表达，且与肿瘤的病理分期、浸润程度、淋巴结转移、患者生存率以及不良预后密切相关[5-7]。本研究旨在通过免疫组化染色法检测USP22在甲状腺乳头状癌、甲状腺腺瘤及结节性甲状腺肿中的表达，分析其与肿瘤临床病理特征的关系，初步探讨USP22表达在甲状腺乳头状癌发生发展中的作用，以期为甲状腺乳头状癌的诊断、治疗和预测疾病转归提供参考。

1 资料与方法

1.1 病例选择 入组标准：①本院初治患者，在我院行手术治疗；②经病理确诊为甲状腺乳头状癌、甲状腺腺瘤和结节性甲状腺肿患者；③术前影像学(彩超或CT)及甲状腺功能等临床资料完整。排除标准：①有甲状腺二次或多次手术史；②术前有头颈部放疗史、化疗史、碘131治疗及生物靶向治疗史。

1.2 标本来源 按照以上标准选取2010-2015年惠州市中心人民医院收治的经手术治疗、经病理确诊、影像学及甲状腺功能等临床资料完整的甲状腺乳头状癌60例。甲状腺癌中男性14例，女性46例；年龄20～80岁，中位数41岁。按照2010年AJCC甲状腺癌TNM分期诊断标准，Ⅰ期48例，Ⅱ期0例，Ⅲ期5例，Ⅳ期7例。甲状腺原发病灶为单一病灶37例，多灶病变23例。原发灶最大直径0.1～6 cm，平均1.845 cm。所有甲状腺乳头状癌患者均行单叶+峡部切除或双叶全切或次全切+Ⅵ区淋巴结探查或清扫术。另随机选取符合入组标准的结节性甲状腺肿10例、甲状腺腺瘤20例作为甲状腺良性结节组(对照组)。

1.3 主要试剂 兔抗人USP22多克隆抗体(产品编号：ab4812，美国Abcam公司)、即用型超敏二步法免疫组化试剂盒(产品编号：PV-9001/PV-9003，北京中杉金桥公司)、DAB显色试剂盒(产品编号：ZLI-9017，北京中杉金桥公司)。

1.4 检测方法采用免疫组化法对石蜡切片组织进行检测。所有组织标本均经10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，以厚4～6 μm连续切片，在75℃烤箱中烘烤1～2 h。经脱蜡复水后将切片泡入0.01 mol/L柠檬酸盐抗原修复缓冲液(pH=6)中在微波炉中大火加热修复15 min。磷酸盐缓冲液(PBS)浸洗、3%过氧化氢封闭后，滴加USP22一抗工作液(工作浓度为1:100)，室温静置1 h后湿盒内4℃孵育过夜。次日滴加适量HRP标记的抗兔二抗，室温孵育40 min。DAB显色、苏木素复染，脱水封片。用已知阳性反应切片作阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照。

1.5 免疫组化结果判定 USP22定位在细胞浆中，呈现棕黄色。免疫组化实验结果数据采用半定量法，在400×视野下，根据阳性细胞数百分比和染色深度，两位病理科医师双盲独立计分。阳性细胞数占比：≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，＞50%为3分。阳性细胞的染色深度：不着色或基本不着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，褐色为3分。将上述两项分数相乘得出最终计分：0～1为阴性(-)，2～3分为弱阳性(+)，4～6分为中度阳性(++)，＞6分为强阳性(+++)。

1.6 统计学方法所有数据应用SPSS19.0软件进行分析，应用两独立样本比较的非参数秩和检验(Wilcoxon秩和检验)分析USP22在甲状腺乳头状癌及良性甲状腺结节组织中的表达是否有统计学差异。应用Wilcoxon秩和检验分析USP22与甲状腺乳头状癌临床病理特征(年龄、性别、肿块大小、多病灶、Ⅵ区淋巴结转移)的关系。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 USP22在甲状腺乳头状癌和良性甲状腺结节中的表达 USP22在甲状腺滤泡上皮中的表达定位于细胞浆。60例甲状腺乳头状癌组织中，4例阴性表达，15例弱阳性表达，25例中等阳性表达，16例强阳性表达。30例良性甲状腺结节组织中，8例阴性表达，11例弱阳性表达，9例中等阳性表达，2例强阳性表达。两样本Wilcoxon秩和检验结果显示，USP22在甲状腺乳头状癌组与良性甲状腺结节组的表达强度差异有统计学意义(Z=-3.317，P=0.001＜0.05)，以甲状腺乳头状癌组较强(秩均值51.67＞33.17)，见表1和图1～6。

表1 USP22在甲状腺乳头状癌、良性甲状腺结节组织中的表达(例)

图1 USP22在甲状腺乳头状癌组织中强性表达(×200)

图2 USP22在甲状腺乳头状癌组织中弱阳性表达(×200)

图3 USP22在甲状腺腺瘤组织中强阳性表达(×200)

图4 USP22在甲状腺腺瘤组织中弱阳性表达(×200)

图5 USP22在结节性甲状腺肿组织中强阳性表达(×200)

2.2 USP22在甲状腺乳头状癌组织中的表达与肿瘤临床病理特征的关系 USP22蛋白阳性表达与患者年龄、性别、肿瘤多灶性、包膜浸润无关(P＞0.05)，而与肿瘤大小、Ⅵ区淋巴结是否转移有关(P＜0.05)，见表2。

图6 USP22在结节性甲状腺肿组织中阴性表达(×200)

表2 甲状腺乳头状癌USP22表达与临床病理特征的关系(例)

3 讨 论

甲状腺结节是内分泌系统的多发病和常见病，近年来发病率逐渐增高。研究发现，在北美，甲状腺癌的发病率以每年超过6%的速度增长，已成为女性恶性肿瘤的第5位[2]。而在我国，甲状腺癌发病率以每年14.51%的速度上升，是近20年来女性恶性肿瘤中增长速度最快的肿瘤之一[8]。早期发现并明确甲状腺结节的性质，可对疾病进行早期干预，且可避免不必要的手术治疗，以及对疾病预后进行评估。

在术前评估甲状腺结节性质时，细针穿刺抽吸活组织检查(fine needle aspiration biospy，FNAB)是灵敏度和特异性最高的方法。对于FNAB难以明确诊断的甲状腺结节，应用免疫组织化学技术检测肿瘤分子标记物并结合FNAB进行病理诊断，可提高术前诊断的准确性[9-10]。选择合适的免疫组化标记抗体在术前评估肿瘤的恶性程度、浸润侵袭性和预后，对于指导临床决定手术方式以及术后进一步治疗有着重要的意义[11]。

USP22是近年来新发现的肿瘤标记物，由Glinsky等[12]于2005年首次发现，属于去泛素化酶(deubiquitinating enzymes，DUBs)家族成员以及癌死亡标记(death-from-cancer signature)基因组成员。人类USP22基因定位于17号染色体，已发现编码氨基酸525个及泛素特异性加工酶(ubiquitin-specifice processing enzymess，UBPs)中去泛素化酶的特定区域，通过泛素介导蛋白酶体途径(ubiquitin-mediated proteasomal pathway)参与细胞内多种蛋白的降解，并调控一系列细胞内活动如细胞生长分化、细胞周期调控、抗原呈递、转录调控及信号转导等。USP22基因已被发现在人体多个组织器官中有表达，如心肌、骨骼肌、肝、肺等，在原始胚胎组织中也有表达，如神经系统组织、生殖腺组织、肝细胞、骨髓细胞等[4]。

研究发现，USP22能够激活c-Myc的转录，影响细胞周期的进程[13]。此外，USP22可通过局部黏着斑酶(focal adhesion kinase，FAK)信号通路和去泛素化上皮间质转化因子TGF-β通路促进上皮间质转化，这与恶性肿瘤的侵袭和转移密切相关[14]。另外，USP22还可去泛素化端粒重复序列连接因子1(telomeric-repeat-binding factor 1，TRF1)，其活性可影响TRF1的稳定性，参与端粒的维持[15]。上述研究结论都表明，USP22的表达在肿瘤细胞增殖、生长的过程中起到了促进作用。

目前已发现USP22在非小细胞肺癌、口腔鳞癌、喉癌等多种肿瘤细胞中高表达，且与肿瘤的病理分期、浸润程度、淋巴结转移、患者生存率以及不良预后密切相关。故USP22可作用一种重要的肿瘤标记物，在临床上可作为评估恶性肿瘤恶性程度、浸润侵袭、不良预后的重要指标。若应用于术前穿刺细胞学检测，可进一步提高病理诊断的准确性，以帮助临床医生更准确地制定下一步治疗方案。

本实验应用免疫组化法对60例甲状腺乳头状癌、20例甲状腺腺瘤以及10例结节性甲状腺肿中USP22蛋白的表达进行检测。结果显示，USP22在甲状腺乳头状癌组织中的表达阳性率明显高于甲状腺腺瘤和结节性甲状腺肿组织，差异具有统计学意义(P＜0.05)，说明USP22可能参与了甲状腺癌发生发展的过程，这与其在其他肿瘤组织中的表达情况一致。

再进一步分析USP22表达与甲状腺乳头状癌各项临床病理特征的关系，结果显示，USP22在有Ⅵ区淋巴结转移的甲状腺癌病例中的表达明显高于无Ⅵ区淋巴结转移的病例，差异具有统计学意义(P=0.028)，在肿瘤最大直径≥2 cm的病例中的表达明显高于肿瘤最大直径＜2 cm的病例，差异具有统计学意义(P=0.006)，而与年龄、性别、多病灶、包膜浸润无关。肿瘤大小体现了肿瘤细胞的增殖能力和速度，淋巴结转移体现了肿瘤细胞失去细胞间黏附、突破包膜向外侵袭、扩散的能力，上述实验结果表明USP22可能有增强甲状腺癌细胞增殖及局部浸润扩散能力的作用。研究表明，Ⅵ区淋巴结转移是甲状腺癌重要的预后因素[16]，此外，鄢丹桂[17]还综合比较了欧洲甲状腺癌协作组、俄亥俄州州立大学、美国纽约纪念Sloan-Kettering癌症中心、全美甲状腺癌协作治疗研究组等甲状腺癌研究中心的分化型甲状腺癌预后评分指标，结果显示大部分研究组均把肿瘤大小纳入预后评分系统中。故本实验结果表明USP22可能有增强甲状腺癌细胞增殖及局部浸润扩散能力的作用。

然而，由于甲状腺乳头状癌的术后预后相对良好，本文未对USP22的表达与甲状腺癌术后的预后关系进行研究，具有一定的局限性。此外，由于甲状腺滤泡性癌、髓样癌以及未分化癌的发病率相对较少，本文亦未做单独统计和讨论，该课题仍有进一步研究的空间。

[1]Sonkar AA,Rajamanickam S,Singh D.Papillary thyroid carcinoma:debate at rest[J].Indian J Cancer,2010,47(2):206-216.

[2]Pathak KA,Leslie WD,Klonisch TC,et al.The changing face of thyroid cancer in a population-based cohort[J].Cancer Med,2013,2(4):537-544.

[3]中华医学会内分泌学分会.甲状腺结节和分化型甲状腺癌诊治指南[J].中华核医学与分子影像杂志,2013,2(33):779-797.

[4]Lee HJ,Kim MS,Shin JM,et al.The expression patterns of deubiquitinating enzymes,USP22 and Usp22[J].Gene Expr Patterns,2006,6(3):277-84.

[5]李丽娟.肿瘤干细胞标记物USP22蛋白在喉鳞状细胞癌中的表达及预后分析[J].中华耳鼻咽喉头颈外科杂志,2014,6(49):479-482.

[6]Ning J,Zhang J,Liu W,et al.Overexpression of ubiquitin-specific protease 22 predicts poor survival in patients with early-stage non-small cell lung cancer[J].Eur J Histochem,2012,56(4):e46.

[7]Piao S,Liu Y,Hu J,et al.USP22 is useful as a novel molecular marker for predicting disease progression and patient prognosis of oral squamous cell carcinoma[J].PLoS One,2012,7(8):e425440.

[8]刘玉琴.中国2003-2007年甲状腺癌发病死亡现状及流行趋势分析[J].中华流行病学杂志,2012,10(33):1044-1048.

[9]Saggiorato E,Cappia S,De Giuli P,et al.Galectin-3 as a presurgical immunocytodiagnostic marker of minimally invasive follicular thyroid carcinoma[J].J Clin Endocrinol Metab,2001,86(11):5152-5158.

[10]吴丽华.常规细针穿刺联合免疫细胞化学在甲状腺乳头状病变诊断中的应用[J].中国实验诊断学,2014,(7):1084-1086.

[11]Wobker SE,Kim LT,Hackman TG,et al.Use of BRAF v600e immunocytochemistry on FNA direct smears of papillary thyroid carcinoma[J].Cancer Cytopathol,2015,123(9):531-539.

[12]Glinsky GV,Berezovska O,Glinskii AB.Microarray analysis identifies a death-from-cancer signature predicting therapy failure in patients with multiple types of cancer[J].J Clin Invest,2005,115(6):1503-1521.

[13]Liu YL,Jiang SX,Yang YM,et al.USP22 acts as an oncogene by the activation of BMI-1-mediated INK4a/ARF pathway and Akt pathway[J].Cell Biochem Biophys,2012,62(1):229-235.

[14]Hu J,Yang D2,Zhang H,et al.USP22 promotes tumor progression and induces epithelial-mesenchymal transition in lung adenocarcinoma[J].Lung Cancer,2015,88(3):239-245.

[15]Atanassov BS,Evrard YA,Multani AS,et al.Gcn5 and SAGA regulate shelterin protein turnover and telomere maintenance[J].Mol Cell,2009,35(3):352-364.

[16]Lee J,Song Y,Soh EY.Central lymph node metastasis is an important prognostic factor in patients with papillary thyroid microcarcinoma[J].J Korean Med Sci,2014,29(1):48-52.

[17]鄢丹桂.甲状腺乳头状癌临床NO患者颈部淋巴结处理[J].中华耳鼻咽喉头颈外科杂志,2012,3(47):257-260.

Expression of USP22 protein in thyroid papillary carcinoma and and its clinical significance.

LUO Zheng-zheng1, YANG Xiao-min2.1.Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery,Huizhou Municipal Central Hospital,Huizhou 516001,Guangdong,CHINA;2.Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery,Huizhou No.1 People Hospital,Huizhou 516001,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the expression of ubiquitin specific protease 22(USP22)in human thyroid papillary carcinoma,thyroid adenoma and nodular goiter,and to analyze its relationship with the clinical pathologic characteristics(gender,age,tumor size,multifocal,central lymph node metastasis).MethodsThe expression of USP22 protein was detected by immunohistochemistry in 10 cases of nodular goiter,20 cases of thyroid adenoma and 60 cases of thyroid papillay carcinoma in Huizhou Municipal Central Hospital from 2010 to 2015.The clinical pathologic factors(gender,age,tumor size,multifocality,extracapsular invasion and central lymph node metastasis)were collected,and the correlation between the expression of USP22 protein and various clinicopathologic factors were analyzed.ResultsThe expression level of USP22 protein in thyroid papillary carcinoma tissues was significantly higher than that in thyroid adenoma or nodular goiter(P＜0.05).The expression of USP22 protein had close correlation with tumor size and central lymph node metastasis(P＜0.05),and had no association with gender,age,multifocality and extracapsular invasion(P＞0.05).ConclusionCompared with nodular goiter and thyroid adenoma,the expression level of USP22 in thyroid papillary carcinoma is significantly higher,and the expression of USP22 protein has close correlation with tumor size and central lymph node metastasis in thyroid papillary carcinoma,which shows that USP22 may be involved in the occurrence and development of thyroid papillary carcinoma,and may be served as a new tumor marker and therapeutic target of thyroid carcinoma.

Thyroid papillary carcinoma;Ubiquitin specific protease 22(USP22);Central lymph node metastasis;Immunohistochemistry

R736.1

A

1003—6350（2017）23—3836—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.23.017

杨小敏。E-mail：hzyxm01@163.com

2017-04-11)