microRNA-34a对人脑胶质瘤细胞生物学特性的影响

段军伟，唐晓平，张涛，赵龙，彭华，段劼

(川北医学院附属医院神经外科，四川 南充 637000)

microRNA-34a对人脑胶质瘤细胞生物学特性的影响

段军伟，唐晓平，张涛，赵龙，彭华，段劼

(川北医学院附属医院神经外科，四川 南充 637000)

目的研究microRNA-34a对人脑胶质瘤细胞生物学特性的影响。方法选取南充市川北医学院附属医院2015年3月至2016年3月收治的100例胶质瘤患者为研究对象，采集胶质瘤组织样本，选取同期在我院接受减压术治疗的40例脑外伤患者为对照，术中采集正常脑组织样本。采用实时荧光定量PCR检测microRNA-34a在胶质瘤组织与正常脑组织样本中表达水平。将转染后人脑胶质瘤细胞系U87分为空白对照组、无义序列转染组及microRNA-34a转染组，检测microRNA-34a对人脑胶质瘤细胞系U87增殖、凋亡、迁移、侵袭能力的影响。结果胶质瘤组织microRNA-34a相对表达量为(0.53±0.48)，显著低于正常脑组织的(1.38±0.25)，差异有统计学意义(P＜0.05)。不同恶化程度胶质瘤组织microRNA-34a相对表达量差异有统计学意义(P＜0.05)。microRNA-34a转染组转染后48 h细胞生长抑制率、转染后细胞凋亡率显著高于空白对照组与无义序列转染组，划痕24 h后细胞迁移数、细胞12 h穿膜数显著低于空白对照组与无义序列转染组，差异均有统计学意义(P＜0.05)。结论microRNA-34a具有抑制胶质瘤细胞增殖、迁移、侵袭，促进肿瘤细胞凋亡等作用。

胶质瘤；microRNA-34a；细胞生物学；增殖；凋亡

胶质瘤是临床常见原发性颅脑肿瘤，具有较高致残率与致死率，对人类健康造成严重威胁[1]。目前胶质瘤治疗主要以手术、放疗、化疗、靶向治疗、中医药治疗等为主，但由于胶质瘤生长速度快，与周围组织界限模糊，侵袭性强，难以彻底根除，治疗后仍具有较高复发风险[2]。近年来研究发现microRNA与胶质瘤发生、发展存在密切联系，为胶质瘤治疗提供新思路[3]。本研究选取我院近年来收治的100例胶质瘤患者为研究对象，采集胶质瘤组织样本，探讨microRNA-34a对人脑胶质瘤细胞生物学特性的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 胶质瘤组织样本 选取南充市川北医学院附属医院2015年3月至2016年3月收治的100例胶质瘤患者为研究对象。纳入标准：(1)符合《中国中枢神经系统胶质瘤诊断与治疗指南(2015)》[4]，经病理组织学证实为胶质瘤患者；(2)初发胶质瘤；(3)在我院接受手术治疗，术前未经放化疗。排除标准：(1)合并有严重心、肺、肝、肾等器官疾病；(2)合并有其他恶性肿瘤；(3)复发性胶质瘤；(4)既往手术史或放化疗史。100例患者中男性68例，女性32例；年龄35～57岁，平均(46.08±10.82)岁；胶质瘤形态学分型：弥漫星形细胞瘤22例，间变星形细胞瘤17例，大脑胶质瘤病11例，少变胶质细胞肿瘤10例，间变少突胶质瘤8例，少突星形细胞瘤12例，室管膜瘤20例；胶质瘤恶性程度分级：Ⅰ级21例，Ⅱ级25例，Ⅲ级40例，Ⅳ级14例。本组患者均接受手术治疗，在术中采集胶质瘤组织样本。选取同期在我院接受减压术治疗的40例脑外伤患者为对照组，其中男性28例，女性12例，年龄26～55岁，平均(40.43±14.39)岁，术中采集正常脑组织样本。胶质瘤组织与正常脑组织取材成功后，迅速置入冻存管，在液氮环境保存。患者或其家属对本研究知情同意并签署知情同意书。

1.1.2 人脑胶质瘤细胞系 人脑胶质瘤细胞系U87购自中科院上海细胞库，采用DMEM培养基培养，含10%小牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素，置于37℃、5%CO2恒温箱培养。

1.2 方法

1.2.1 实时荧光定量PCR(Real-time PCR) 取50 mg组织标本，研磨成浆，采用Trizol法提取总DNA，microRNA提取试剂盒购自德国Roche公司。根据逆转录试剂盒(美国Invitrogen)说明书反转录cDNA。本实验以U6作为内源性参照，microRNA-34a相对表达量采用2△△Ct计算。Real-time PCR购自美国Invirogen公司，实验步骤严格按照试剂盒说明书进行，PCR 循环参数：95℃，5 min；95℃，15 s；65℃，15 s；72℃，32 s；95℃，15 s，共40个循环，4℃保存。

1.2.2 细胞培养 取出液态氮冷藏人脑胶质瘤细胞系U87冻存管，浸入37℃水浴中摇动融化，吸出细胞悬液转入离心管，滴加10 mL培养液，置入离心机，1 000 r/min离心5 min。弃置上清液，加入10%小牛血清培养基，37℃、5%CO2恒温箱静置培养，次日更换培养基，继续培养。在倒置显微镜下，采用血细胞计数板法直接计数，计算细胞密度。

1.2.3 细胞转染 取对数生长期脑胶质瘤细胞系U87，种植于24孔板中，转染前细胞密度培养达到70%～90%。转染步骤严格按照Lipofectamine 2000(美国Invitrongen公司)试剂盒说明书。在37℃、5%CO2恒温箱中培养48 h后，提取总DNA，行反转录cDNA，实验步骤与上同。采用Real-time PCR检测转染后microRNA-34a表达情况。

1.2.4 CCK-8法检测细胞增殖 取出转染后人脑胶质瘤细胞系U87，分为空白对照组、无义序列转染组以及microRNA-34a转染组。转染前1 d将细胞消化接种至24孔培养板，约5×103细胞/孔，次日以50 mol/L转染浓度转染，设置4个复孔，以及只加细胞培养液和CCK-8工作液的空白孔，置入37℃、5%CO2恒温箱中培养24 h。细胞转染后每12 h使用酶标仪在450 nm处检测三组细胞吸光度，计算三组细胞生长抑制率。

1.2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡 取出转染后人脑胶质瘤细胞系U87，分组方法同上。置入37℃、5%CO2恒温箱中培养48 h，将细胞吹打成单细胞悬液，加入缓冲液洗涤，1 000 r/min离心4 min，弃置缓冲液，加入5 μL AnnexinV-FITC和5 μL PI染色，震荡混匀，室温避光15 min。加入200 μL Binding buffer重悬细胞浓度，采用流式细胞仪检测转然后细胞凋亡情况。

1.2.6 划痕实验检测细胞迁移 取出转染后人脑胶质瘤细胞系U87，分组方法同上。将三组细胞制备为悬液，接种至六孔板中，置入37℃、5%CO2恒温箱中培养24 h。次日用20 μL移液器沿培养孔底部作直线划痕，呈一字型，划痕过程严格无菌。采用缓冲液冲洗划痕，加入培养液，置入用37℃、5%CO2恒温箱中培养24 h。观察划痕区域细胞迁移情况。

1.2.7 Transwell法检测细胞侵袭 取出转染后人脑胶质瘤细胞系U87，分组方法同上。加入10%小牛血清培养基，长势良好可换用无血清培养液，置入37℃、5%CO2恒温箱中培养24 h。采用人工基质胶构建侵袭小室，均匀铺满所有微孔，室温放置1 h凝胶。将Transwell小室放入24孔培养板，上室加入100 μL人脑胶质瘤细胞系U87悬液，下室加入10%小牛血清培养基500 μL，置入37℃、5%CO2恒温箱中培养48 h。用缓冲液淋洗Transwell小室，再用棉签擦去滤膜上层细胞。0.1%结晶紫溶液染色30 min，采用显微镜选取5个200倍视野计算穿过小室底膜的细胞数。

1.3 统计学方法应用统计学软件SPSS19.0进行统计分析，计量资料以均数±标准差(x-±s)表示，组间比较进行t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 microRNA-34a在胶质瘤与正常脑组织中的表达 在胶质瘤组织与正常脑组织样本中均可检测到microRNA-34a表达。正常脑组织microRNA-34a相对表达量为(1.38±0.25)，高于胶质瘤组织microRNA-34a相对表达量(0.53±0.48)，差异有统计学意义(t=9.310，P＜0.05)。Ⅰ级胶质瘤组织microRNA-34a相对表达量为(0.83±0.18)，Ⅱ级为(0.67±0.19)，Ⅲ级为(0.35±0.12)，Ⅳ级为(0.10±0.05)。不同恶化程度胶质瘤组织microRNA-34a相对表达量差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.2 Real-time PCR检测microRNA-34a的转染效果 在人脑胶质瘤U87细胞系中，microRNA-34a转染组microRNA-34a表达量为(6.06±0.15)，显著高于空白对照组的(1.67±0.18)与无义序列转染组的(1.59±0.20)，差异有统计学意义 (t=91.788、87.594，P＜0.05)。

2.3 microRNA-34a对脑胶质瘤细胞增殖的影响 microRNA-34a转染组转染后12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h细胞生长抑制均显著高于空白对照组与无义序列转染组，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

2.4 microRNA-34a对脑胶质瘤细胞凋亡的影响 microRNA-34a转染组转染后细胞凋亡率为(8.79±2.82)%，显著高于空白对照组的(4.88±1.14)%与无义序列转染组的(5.12±1.69)%，差异均有统计学意义(t=12.595、10.938，P＜0.05)。

表1 三组转染细胞生长抑制率(%±s)

表1 三组转染细胞生长抑制率(%±s)

组别microRNA-34a转染组空白对照组无义序列转染组检验值1(microRNA-34a转染组vs空白对照组)检验值2(microRNA-34a转染组vs无义序列转染组)检验值3(空白对照组vs无义序列转染组)转染后12 h 12.54±2.17 4.42±0.89 4.88±1.04 t=16.961 P＜0.05 t=15.595 P＜0.05 t=1.646 P＞0.05转染后24 h 18.92±3.34 5.63±1.25 6.34±1.29 t=18.257 P＜0.05 t=17.213 P＜0.05 t=1.936 P＞0.05转染后36 h 27.65±2.05 6.85±0.95 5.82±1.35 t=45.099 P＜0.05 t=43.569 P＜0.05 t=3.057 P＜0.05转染后48 h 38.40±4.11 6.16±0.93 7.55±2.19 t=37.481 P＜0.05 t=32.453 P＜0.05 t=2.862 P＜0.05转染后60 h 35.17±3.63 8.92±1.31 8.46±1.74 t=33.323 P＜0.05 t=32.506 P＜0.05 t=1.035 P＞0.05转染后72 h 18.96±3.22 7.73±1.65 8.20±1.63 t=15.205 P＜0.05 t=14.606 P＜0.05 t=0.993 P＞0.05

2.5 microRNA-34a对脑胶质瘤细胞迁移的影响 microRNA-34a转染组划痕24 h后细胞迁移数为(79.25±6.21)，显著低于空白对照组的(168.49±11.75)与无义序列转染组的(151.44±10.32)，差异均有统计学意义(t=16.448、14.681，P＜0.05)。

2.6 microRNA-34a对脑胶质瘤细胞侵袭的影响 microRNA-34a转染组细胞12 h穿膜数为(52.35±4.78)，显著低于空白对照组的(233.47±13.95)与无义序列转染组的(219.22±10.76)，差异均有统计学意义(t=60.172、69.432，P＜0.05)。

3 讨 论

胶质瘤是最常见的恶性中枢神经系统肿瘤，具有极高侵袭性，手术根除难度大，患者复发率高，联合放化疗也无法取得较佳疗效[5]。胶质瘤恶性进展分子机制，与如何抑制胶质瘤侵袭能力，是目前临床神经外科重要研究课题[6]。microRNA是新近发现的一类非编码单链RNA分子，含18～25个核苷酸，在细胞内具有多种重要调节作用[7]。目前已发现28 645个microRNA，越来越多研究证实microRNA参与胶质瘤发生、发展。李星光等[8]发现microRNA-17高表达与胶质瘤患者预后不良存在密切联系。李新星等[9]指出microRNA-221是抑癌基因p27Kipl的调控因子，可以通过抑制p27Kipl基因表达，激活胶质瘤细胞，影响治疗与预后。郎博娟等[10]认为microRNA-184低表达可以抑制肿瘤细胞凋亡，加速肿瘤细胞增殖，在胶质瘤发生、发展中占有重要地位。赵焱等[11]发现microRNA-93可以通过介导转化生长因子-β R2表达，减弱胶质瘤细胞侵袭能力。根据microRNA在胶质瘤发展中的作用，可将microRNA分为致癌基因与抑癌基因，前者促进胶质瘤细胞分化、增殖、迁移、侵袭，后者参与肿瘤细胞凋亡，调控肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭。MicroRNA-34a是一种microRNA抑癌基因，广泛分布于心、肺、肝、脑等组织中，其编码基因位于1号染色体短臂。近年来研究证实microRNA-34a可以抑制多种肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭。袁汇等[12]发现宫颈癌患者体内microRNA-34a表达显著下降，microRNA-34a可以作为宫颈癌治疗靶点。庄彪等[13]认为microRNA-34a高表达可以抑制结肠癌细胞增殖、迁移、侵袭。金向宇等[14]指出microRNA-34a可以通过调节Bcl-2、C-MYC、P53等基因，促进肺癌细胞凋亡，抑制肿瘤细胞迁移、侵袭。为阐明microRNA-34a在过程中作用，本研究首先比较正常脑组织与胶质瘤组织样本microRNA-34a表达量，以及不同恶化程度胶质瘤组织microRNA-34a表达量，发现随胶质瘤恶化程度上升，microRNA-34a相对表达量逐渐降低，提示microRNA-34a与胶质瘤发生、发展存在密切联系，可以指导胶质瘤分级。细胞增殖指细胞通过分裂产生新个体的过程，是生物体重要生命特征。恶性肿瘤通过肿瘤细胞增殖方式不断发展恶化[15]。本研究采用经典CCK-8实验检测microRNA-34a对胶质瘤细胞生长抑制作用，结果显示microRNA-34a转染组转染后12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h细胞生长抑制率均显著高于空白对照组与无义序列转染组，表明microRNA-34a可以减弱胶质瘤细胞增殖能力。肿瘤发生是细胞凋亡受阻造成的肿瘤细胞失控生长，过度增殖[16]。抑制肿瘤细胞抗凋亡能力，诱导肿瘤细胞凋亡，是肿瘤治疗重要机制。正常细胞不会被AnnexinV-FITC与PI染色，早期凋亡细胞可被AnnexinV-FITC染色而不会被PI染色，晚期凋亡细胞与坏死细胞可被AnnexinV-FITC与PI染色。本次实验证实，microRNA-34a转染组转染后细胞凋亡率显著增高，与空白对照组、无义序列转染组比较差异有统计学意义，表明microRNA-34a具有诱导胶质瘤细胞凋亡的能力。迁移指肿瘤细胞随血液、淋巴转移至其他部位，侵袭指肿瘤细胞在原发部位浸润，两者均为恶性肿瘤重要生物学特性。相关研究显示，胶质瘤具有较强迁移、侵袭能力，发生机制可能与肿瘤细胞黏附、局部基质降解、肿瘤血管新生等相关[17]。本研究分别采用划痕实验与Transwell法检测人脑胶质瘤细胞迁移与侵袭能力，结果显示microRNA-34a转染组划痕24 h后细胞迁移数、细胞12 h穿膜数显著低于空白对照组与无义序列转染组，提示microRNA-34a可以有效抑制胶质瘤细胞迁移、侵袭能力。

综上所述，microRNA-34a在胶质瘤组织中呈低表达，随病理分级增高而降低。microRNA-34a高表达可以抑制胶质瘤细胞增殖、迁移、侵袭，诱导肿瘤细胞凋亡。

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Effect of microRNA-34a on biological characteristics of human brain glioma cells.

DUAN Jun-wei,TANG Xiao-ping,ZHANG Tao,ZHAO Long,PENG Hua,DUAN Jie.Department of Neurosurgery,Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College,Nanchong 637000,Sichuan,CHINA

ObjectiveTo investigate the effect of microRNA-34a on the biological characteristics of human brain glioma cells.MethodsA total of 100 patients with glioma who were admitted in Department of Neurosurgery,Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College from March 2015 to March 2016 were enrolled as the subjects.The glioma tissues were collected.Forty patients with brain trauma treated by decompression in our hospital were selected as controls,and normal brain tissue samples were collected during the operation.The expression levels of microRNA-34a in glioma tissues and normal brain tissues were detected by real-time quantitative PCR.The human cerebral glioma cell line U87 after transfection were divided into the blank control group,nonsense sequence transfection group and microRNA-34a transfection group.The effect of microRNA-34a on the proliferation,apoptosis,migration and invasion ability of human glioma cell line U87 was detected.ResultsThe relative expression level of microRNA-34a in glioma tissues was significantly lower than that in normal brain tissues,(0.53±0.48)vs(1.38±0.25),P＜0.05.The relative expression level of microRNA-34a showed significantly differences in different deteriorated glioma tissues(P＜0.05).48 hoursafter transfection,the cell growth inhibition rate and cell apoptosis rate after transfection in microRNA-34a transfection group were significantly higher than those in the blank control group and the nonsense sequence transfection group(P＜0.05).The number of migrating cells in 24 hours after scratch and number of cells penetrating membrane in 12 hours were significantly lower than those in the blank control group and nonsense sequence transfection group(P＜0.05).ConclusionmicroRNA-34a can inhibit the proliferation,migration and invasion of glioma cells and promote the apoptosis of tumor cells.

四川省医学科研青年创新课题计划(编号：Q15079)

段军伟。E-mail：kmcvdeng@126.com

Glioma;microRNA-34a;Cell biology;Proliferation;Apoptosis

R730.264

A

1003—6350（2017）23—3826—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.23.014

2017-05-25)