加味地黄饮子方干预自然衰老鼠与正常成年鼠免疫功能的对比性研究*

( 150040)

黑龙江中医药大学附属第一医院

加味地黄饮子方干预自然衰老鼠与正常成年鼠免疫功能的对比性研究*

高山谢宁Δ王海艳ΔΔ唐伟懿Δ马嫡Δ(哈尔滨150040)

黑龙江中医药大学附属第一医院

目的：比较加味地黄饮子方对自然衰老鼠与正常成年鼠免疫功能的影响。方法：选取SD雄性大鼠，24月龄20只作为自然衰老实验组，选取12月龄20只作为正常成年对照组。2组大鼠给予加味地黄饮子灌胃，8周后检测免疫指标。比较2组间白细胞计数、中性粒细胞比例、淋巴细胞比例，比较T细胞CD4+、CD8+、CD3+比例，比较NK细胞、巨噬细胞、B细胞比例，比较IgA、IgG、IgM含量的差异 。结果：自然衰老组大鼠的淋巴细胞比例升高；T 细胞CD4+和CD3+比例升高、CD8+比例降低；NK细胞、巨噬细胞、B细胞比例升高；IgA、IgG、IgM含量升高。结论：加味地黄饮子方可以提高自然衰老大鼠的免疫功能，可通过影响免疫功能发挥延缓衰老的作用。

加味地黄饮子方；自然衰老鼠；正常成年鼠；免疫功能；对比性研究

衰老是自然界最复杂的生理现象之一,是任何生物都不能避免的生命过程。人体在遗传因素调控下，随着时间推进逐渐成熟，而后出现各系统、渐进性、不可逆转的自然衰老。本课题拟从对免疫系统功能影响的角度，对加味地黄饮子抗衰老的内在机制进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1 实验动物 自北京维通利华公司购入雄性24月龄SD大鼠20只为自然衰老实验组，12月龄大鼠20只为正常成年对照组。

1.2 药物制备与试剂 加味地黄饮子方由古方地黄饮子化裁而成，去掉附子，肉桂变为桂枝，加入人参、血竭、珍珠等药物。加味地黄饮子方水煎剂的制备：将3剂成人剂量的加味地黄饮子饮片(共453 g)浸泡2 h，然后武火加热，煮沸后改用文火慢煎30 min，取煎液2次将其混合过滤，再将滤液文火煎煮浓缩至220 mL(药液含生药量2.059 g/mL,黑龙江中医药大学中医基础理论实验室煎制)。NK1.1、CD11b、F4/80、CD4抗体(美国BD公司)，大鼠 IgA、IgG、IgM ELISA 试剂盒(杭州联科公司)。

1.3 实验仪器 流式细胞仪 6HT(武汉科力瓦贸易有限公司)，全自动血液分析仪 BC-1800(山东博科生物产业有限公司)，EnVision R 多功能酶标仪(上海珀金埃尔默有限公司)。

1.4 干预方法 2组大鼠釆用加味地黄饮子20.6 g/kg·d-1的剂量灌胃，每日1次，观察8周。

1.5 指标测定 给药后第 4、8周，大鼠眼内眦取血，EDTA-K3 抗凝，血细胞计数仪测定外周血白细胞计数、淋巴细胞比例、中性粒细胞比例。流式细胞仪检测T淋巴细胞分型中CD4+、CD8+、CD3+细胞比例。检测外周血NK细胞、巨噬细胞、B细胞比例。检测外周血 IgA、IgG、IgM值。

2 结果

2.1 白细胞计数、中性粒细胞比例、淋巴细胞比例比较 对比白细胞计数发现，成年鼠白细胞计数在4周与8周比较差异无显著性(P>0.05);老年鼠8周白细胞计数较4周有所下降(P<0.05)，老年鼠4、8周白细胞计数明显低于成年鼠(P<0.05)。对比中性粒细胞比例发现，成年鼠8周中性粒细胞比例较4周有所提高(P<0.05)，而老年鼠8周中性粒细胞比例较4周有所下降(P<0.05)；老年鼠4周中性粒细胞比例与成年鼠比较差异无显著性(P>0.05)，老年鼠8周中性粒细胞比例明显低于成年鼠(P<0.05)。对比淋巴细胞比例发现，成年鼠淋巴细胞比例在4周与8周比较差异无显著性(P>0.05)，老年鼠8周淋巴细胞比例较4周有所上升(P<0.05)，且老年鼠8周淋巴细胞比例明显高于成年鼠(P<0.05)，而老年鼠4周淋巴细胞比例与成年鼠比较差异无显著性(P>0.05)。详见表1。

组别n白细胞(×1000个/μm3)4周8周中性粒细胞(%)4周8周淋巴细胞(%)4周8周成年组2010.3±1.911.5±1.756.7±13.180.8±20.4*44.6±13.749.5±1.06老年组206.5±1.2#4.2±1.1#*62.6±19.534.4±10.3#*47.3±21.765.8±22.1#*

注：与成年组比较，#P<0.05；与组内4周比较，*P<0.05

2.2 T淋巴细胞分型比例比较 对比CD4+T细胞比例发现：成年鼠和老年鼠8周CD4+比例较4周有明显的提高(P<0.05)，且老年鼠4、8周CD4+比例明显低于成年鼠(P<0.05)。对比CD8+T细胞比例发现：成年鼠和老年鼠8周CD8+比例较4周有明显的下降(P<0.05)，老年鼠4、8周CD8+比例明显高于成年鼠(P<0.05)。对比 CD3+细胞比例发现：成年鼠和老年鼠8周CD3+比例较4周有明显的提高(P<0.05)，老年鼠4、8周CD3+比例明显低于成年鼠(P<0.05)。详见表2。

组别nCD4+4周8周CD8+4周8周CD3+4周8周成年组2061.4±15.992.3±9.7*50.4±8.7 36.9±12.3* 57.4±1.685.6±8.8* 老年组2025.7±3.1#70.6±21.4#75.2±14.0#53.1±10.9#*32.8±5.5#62.0±11.1#*

注：与成年组比较，#P<0.05；与组内4周比较，*P<0.05

2.3 NK细胞、B细胞、巨噬细胞比例比较 对比NK细胞比例发现：成年鼠和老年鼠8周NK细胞比例较4周分别有明显上升(P<0.05)，老年鼠4、8周NK细胞比例明显低于成年鼠(P<0.05)。对比B细胞比例发现：成年鼠和老年鼠8周B细胞比例较4周有明显的上升(P<0.05)，老年鼠4、8周B细胞比例明显低于成年鼠(P<0.05)。对比巨噬细胞比例发现：成年鼠和老年鼠8周巨噬细胞比例较4周有明显的上升(P<0.05)，8周巨噬细胞比例老年鼠与成年鼠比较差异无显著性(P>0.05)，老年鼠4周巨噬细胞比例明显低于成年鼠(P<0.05)。详见表3。

2.4 IgA、IgG、IgM含量比较 对比 IgA含量发现：成年鼠和老年鼠8周IgA含量较4周有明显上升(P<0.05)，老年鼠4、8周IgA含量明显低于成年鼠(P<0.05)。对比IgG含量发现：成年鼠和老年鼠8周IgG含量较4周有明显上升(P<0.05)，老年鼠4、8周IgG含量明显高于成年鼠(P<0.05)。对比IgM含量发现：成年鼠和老年鼠8周IgM含量较4周有明显上升(P<0.05)，4、8周IgM含量老年鼠与成年鼠比较差异无显著性(P>0.05)。详见表4 。

组别nNK细胞4周8周B细胞4周8周巨噬细胞4周8周成年组2053.2±1.182.5±18.8*55.4±12.177.9±18.1*61.2±21.581.7±23.2*老年组2045.7±25.4#62.4±15.1#*38.4±6.7#50.6±8.8#*32.4±25.0#77.3±30.4*

注：与成年组比较，#P<0.05；与组内4周比较，*P<0.05

组别nIgA4周8周IgG4周8周IgM4周8周成年组2032.7±14.880.5±19.3*26.8±9.4 49.2±15.3*70.1±12.3114.5±36.2*老年组2015.3±3.3#52.9±12.7#*53.4±16.9#76.2±14.0#*68.3±9.7△90.6±25.7*

注：与成年组比较，#P<0.05，△P>0.05；与组内4周比较，*P<0.05

3 讨论

研究发现人体免疫系统的功能随时间不断进行调整重塑，随年龄增长功能不断下降，呈现老化状态。[1]对生理年龄较长的人群，如百岁老人进行研究，发现其免疫系统功能良好，保持在较高的水平运行。据分析免疫功能的完好与长寿存在相关性。在衰老过程中淋巴细胞明显生成减少、凋亡较高，而出现整体水平下降。[2]免疫系统对抗原的应答水平也随之下降，所以老年人群多见容易感染、肿瘤高发的现象。老年人在疾病过程中外界抗原和病原体不断刺激并消耗T淋巴细胞。大量实验证实T细胞因为凋亡受损发生克隆性扩增。[3]进入老龄期后人体老化代表细胞T细胞CD8+比例上升，而清除肿瘤细胞起着极其重要作用的CD4+数量下降。[4]衰老使B淋巴细胞的数量和功能下降。细胞内环境紊乱导致B细胞分泌免疫球蛋白减少，破坏B细胞的形成，使免疫球蛋白的多样性和黏附性下降。[5]研究表明老年人和老龄鼠的B细胞存在协同刺激因子的减少、受体信号减弱等内在缺陷，起保护作用的免疫球蛋白亲和性和滴度下降。NK细胞通过细胞毒作用对抗、杀灭肿瘤细胞。老年期NK细胞的细胞毒作用大幅降低，如果保持相应的抗肿瘤作用，就需要更多数量的NK细胞来补充足量的细胞溶解能力。[6]

中医药延缓衰老的作用受到日益广泛的关注，其研究也越来越深入。在临床大量应用中，笔者观察到地黄饮子加减方对改善早衰症状有很好的的作用。本实验对加味地黄饮子通过影响免疫功能发挥抗衰老的作用进行深入的研究，笔者对正常的成年大鼠和自然衰老大鼠进行加味地黄饮子干预，观察它们免疫系统的变化。对比研究发现加味地黄饮子可不同程度的提高自然衰老大鼠淋巴细胞比例，提高正常的成年鼠和自然衰老大鼠CD4+和CD3+细胞比例，降低CD8+细胞比例，提高正常的成年鼠和自然衰老鼠NK细胞、B细胞、巨噬细胞比例和血浆 IgA、IgG、IgM的含量。地黄饮子方具有开窍、化痰、补肾、活血的功效，方药组成中的有效成分为延缓自然衰老发挥了重要的药理作用。[7-9]影响自然衰老的因素很多如氧化应激衰老、间质损伤衰老、糖基化终产物衰老等，这也是我们今后可能的研究方向。本实验从加味地黄饮子方对免疫系统的影响粗浅分析其延缓衰老的内在原因，试图从多方面、多角度、多层次去探讨加味地黄饮子方延缓衰老的作用机制。

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ComparativeStudyofInterventionofJiaweiDihuangYinziFangonImmuneFunctioninNaturalAgingRatsandNormalAdultRats

GAOShanXIENingWANGHai-yanTANGWei-yiMADi(Harbin 150040)

First Affiliated Hospital,Heilongjiang University of Chinese Medicine

Objective: to compare the effects ofJiaweiDihuangYinziFangon the immune function in natural aging rats and normal adult rats. Methods: 20 SD male rats of 24 months old were selected as experimental group of natural aging, and 20 rats of 12 months old as normal adult control group. Both groups were treated with intragastric administration withJiaweiDihuangYinziFangto detect immunological index after 8 weeks. Compare white blood cell count the proportions of neutrophils and lymphocytes in the 2 groups, compare the proportions of T-cells of CD4+, CD8+and CD3+, compare the proportions of NK cells, macrophages and B cells, and compare the differences of IgA, IgG and IgM contents. Results: In natural aging group, lymphocytes increased; CD4+and CD3+increased; CD8+decreased; NK cells, macrophages and B cells increased; and the contents of IgA, IgG and IgM increased. Conclusion:JiaweiDihuangYinziFangcan improve the immune function of natural aging rats, and can play the role of anti-aging by affecting immune function.

JiaweiDihuangYinziFang; natural aging rat; normal adult rat; immune function; comparative study

R285.5

A

1007-5615(2017)06-0004-04

* 国家自然科学基金资助项目：No.81573863；哈尔滨市科技局青年后备人才项目：No.2017RAQXJ170

Δ 黑龙江中医药大学(哈尔滨 150040)

ΔΔ 黑龙江省中医医院(哈尔滨 150036)

谢宁，男，教授，博士生导师。

(2017-10-17 收稿)