索拉非尼与阿帕替尼对人肝癌 SMMC-7721细胞的抑制作用比较

王 一，李锦毅

原发性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）位于世界恶性肿瘤的第6位[1]，其病死率居第3位。大部分肝癌患者就诊时已是中晚期，而晚期HCC的预后较差[2]。索拉非尼是多靶点酪氨酸激酶抑制剂，是唯一被美国食品药物管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准的用于肝癌晚期患者的药物[3]，然而索拉非尼治疗晚期肝癌的中位生存期也仅有1年，治疗效果仍不尽人意。阿帕替尼是酪氨酸激酶受体抑制剂，为我国自主研制的小分子抗血管生成靶向药，其可通过抑制恶性肿瘤血管的生成，达到抗肿瘤作用[4]。本研究对比分析索拉非尼与阿帕替尼对人肝癌SMMC-7721细胞体外增殖、迁移及相关因子的作用，以对比两者抑制作用的强弱。

1 材料与方法

1.1 主要材料与设备 人肝癌细胞株SMMC-7721由军事医学科学院提供。索拉非尼购自拜耳先灵医药公司，阿帕替尼购自江苏恒瑞医药公司，胎牛血清、RPMI1640培养基购自美国Gibco公司，胰蛋白酶购自Difco公司，二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、四甲基偶氮唑盐[3-（4,5）-dimethylthiahiazo（-z-y1）-3,5-di-phenytetrazoliumromide，MTT]试剂盒购自美国Sigma公司，人-血管内皮生长因子（vascular endothelial growthfactor，VEGF）酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒、人-肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）ELISA试剂盒、人-白介素6（interleukin-6，IL-6）ELISA试剂盒购自北京博凌科为生物科技有限公司。超净工作台、CO2细胞培养箱（美国Thermo公司），手持式细胞计数仪（德国Millipore公司），倒置显微镜（日本Olympus公司），电子天平（上海精密仪器厂）。

1.2 方法

1.2.1 肝癌细胞的培养 人肝癌SMMC-7721细胞用含10%胎牛血清、1%青链霉素的RPMI1640培养液，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。0.25%胰酶消化传代。隔天换液1次，2～3 d 进行一次传代。

1.2.2 MTT法检测药物抑制率 收集处于对数生长期细胞后进行细胞计数，5000个/100 µl接种于96孔板，置于37℃、含5% CO2细胞培养箱。培养24 h后，分别加入索拉非尼（索拉非尼组）6.25 µg/ml、12.5 µg/ml、50µg/ml、100 µg/ml、200 µg/ml，阿帕替尼（索拉非尼组）6.25 µg/ml、12.5 µg/ml、50 µg/ml、100 µg/ml、200 µg/ml，每个浓度设3～5个复孔，对照组加入完全培养基。分别于24、48、72、96 h时，MTT法检测各组光密度（optical density，OD）值，以只加DMSO孔为调零孔，设3～5个复孔。细胞生长抑制率=[1－（实验组平均OD值－调零孔平均OD值）/（对照组平均OD值－调零孔平均OD值）]×100%。

1.2.3 细胞划痕实验 收集对数期细胞计数后，每孔5×105个/ml铺于6孔培养板中，置入37℃、含5%CO2的细胞培养箱内过夜培养。用1 ml枪头在每孔垂直画线，磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）冲洗3次，去除划下的细胞，加入培养基培养。加入索拉非尼、阿帕替尼各浓度药物1 ml，使药物终浓度为：6.25µg/ml、12.5 µg/ml、50 µg/ml、100 µg/ml、200 µg/ml。对照组加入1 ml无血清培养基，每组设5个复孔，放入细胞培养箱中继续培养。24、48、72 h后显微镜下观察迁移情况并拍照；用Imag J软件分析细胞的迁徙面积比率。

1.2.4 ELISA实验检测VEGF、TNF-α及IL-6含量收集对数期细胞计数后，每孔4×104个/500 µl接种于12孔培养板，置于37℃、含5%CO2的细胞培养箱内过夜培养。24 h后加入索拉非尼、阿帕替尼各浓度药物500 µl，使药物终浓度为：6.25 µg/ml、12.5 µg/ml、50 µg/ml、100 µg/ml、200 µg/ml；对照组加入500 µl完全培养基，每组设置5个复孔，置入培养箱培养。72 h后，收集细胞上清液，离心（500×g，5 min）去除杂质，按照试剂盒说明进行ELISA实验。

1.3 统计学处理 采用SPSS 18.0统计软件包进行统计学分析，计量资料以表示，方差齐时组间比较采用独立样本t检验，方差不齐时组间比较采用t'检验；三组间比较采用单因素方差分析，方差齐时两两比较采用LSD-t检验，方差不齐时采用Tamhane检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 索拉非尼、阿帕替尼对SMMC-7721细胞增殖的影响 由图1、图2可见，随着药物浓度的增加，索拉非尼、阿帕替尼对细胞增殖的抑制能力增强。其中，200 µg/ml时抑制效果最好，所以后续细胞划痕实验和细胞因子比较均选择药物浓度200 µg/ml。由表1可知，每种药物浓度下索拉非尼组细胞的生长抑制率均高于阿帕替尼组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图1 各浓度索拉非尼对SMMC-7721细胞增殖的抑制作用

图2 各浓度阿帕替尼对SMMC-7721细胞增殖的抑制作用

表1 不同浓度索拉非尼和阿帕替尼对SMMC-7721细胞生长抑制率的比较（n=15，%

表1 不同浓度索拉非尼和阿帕替尼对SMMC-7721细胞生长抑制率的比较（n=15，%

组别 药物浓度（µg/ml）6.25 12.5 50 100 200阿帕替尼组 7.02±3.3015.49±7.8634.47±1.0442.32±1.4050.25±0.75索拉非尼组 20.58±1.9245.38±4.1067.09±1.8380.77±1.8185.60±0.94 t/ t’值 －13.756 －13.058 －60.021 －65.079 －113.851 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.2 细胞划痕实验 由图3A、图3B、图3C可见，对照组迁徙范围最大，索拉非尼组最小。索拉非尼组、阿帕替尼组和对照组迁徙面积比率分别为（0.26±0.012）%、（0.46±0.011）%和（0.66±0.023）%，三组迁徙面积比率差异有统计学意义（F=746.020，P＜0.001），两两比较，索拉非尼组、阿帕替尼组细胞迁徙面积比率小于对照组（P＜0.05），索拉非尼组小于阿帕替尼组（P＜0.05），见图3D。

图3 各组癌细胞迁徙面积

2.3 两药物组中VEGF 、TNF-α、IL-6的水平 三组间 VEGF（F=605.850，P＜0.001）、TNF-α（F=758.072，P＜0.001）及IL-6（F=822.000，P＜0.001）的含量差异均有统计学意义，进一步两两比较显示：索拉非尼组、阿帕替尼组的VEGF、TNF-α及IL-6的含量均小于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；索拉非尼组的VEGF、TNF-α及IL-6的含量均小于阿帕替尼组，且差异有统计学意义（P＜0.05，表2）。

表2 对照组、索拉非尼组和阿帕替尼组SMMC-7721细胞相关因子浓度比较

表2 对照组、索拉非尼组和阿帕替尼组SMMC-7721细胞相关因子浓度比较

注：VEGF，血管内皮生长因子；TNF-α，肿瘤坏死因子α；IL-6，白介素6；与对照组比较，①P＜0.05；与阿帕替尼组比较，②P＜0.05

组别 例数 VEGF TNF-α IL-6对照组 15 154.25±3.31 110.18±4.64 71.41±1.45阿帕替尼组 15 130.31±2.10① 83.31±2.44① 60.84±1.46①索拉非尼组 15 109.14±4.74①② 62.07±2.65①② 51.60±1.07①②

3 讨 论

HCC大多数发现时已是进展期，约1/3能进行潜在性的根治治疗，如切除术及肝移植[5]。HCC的进展是一个多阶段过程，涉及大量基因突变。目前，已知几个关键的分子途径参与其中，包括血小板衍生生长因子受体（plateletderived growth factor receptor，PDGFR）、VEGF、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth facto，FGF），表皮生长因子受体（epidermalgrowth factor receptor，EGFR），RAS /RAF /MEK /ERK和PI3K/ AKT /mTOR途径等[6]。

目前，HCC的治疗方法一般依据巴萨罗那分期[7]制定，对于巴塞罗那分期为B期的患者，经动脉化疗栓塞术（trans arterial chemoembolization，TACE）可以提高其中位总生存期[8]；晚期HCC的患者（巴塞罗那分期为C的患者）预后较差，中位生存期仅有6.6个月。

近年来，抗肿瘤血管生成药成为治疗的热点，并研制出一批抗血管生成药物。肝脏是富血供的器官，肝癌细胞的生长繁殖、浸润、扩散均与肿瘤富血供有关[9]。因此，抗血管生成成为肝癌治疗研究的一个重要方向，成为肿瘤治疗的新策略。VEGF是体内最强的血管生长因子[10]。VEGF与其受体（VEGFR）相结合可诱导肿瘤血管生成、促进肿瘤生长，还能诱导生存素的表达而保护肿瘤内皮细胞逃避化疗引起的凋亡[11]。TNF-α和IL-6是炎性反应的因子之一，参与细胞微环境的改变[12-14]，对肝癌肿瘤细胞有着直接细胞毒作用。因此，本研究选取VEGF、TNF-α和IL-6作为反映细胞因子抑制作用的指标。

多靶点酪氨酸激酶抑制剂索拉非尼能够抑制VEGFR-1，VEGFR-2和VEGFR-3，是唯一被美国FDA批准用于肝癌晚期患者的药物，且在治疗晚期肝癌上取得了突破性进展。阿帕替尼是我国自主研制的抗血管生成靶向药，是酪氨酸激酶受体抑制剂，通过结合细胞内VEGFR-2的腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）位点，阻断下游细胞信号传导来抑制恶性肿瘤血管生成[15]。阿帕替尼被证实在晚期胃癌患者中安全有效[16]。目前已被我国食品药品监督管理总局批准用于治疗二线化疗失败的晚期胃癌患者。

本实验中，MTT检测两药物对肝癌细胞的生长抑制率结果显示：每种药物浓度下，索拉非尼组生长抑制率高于阿帕替尼组，由此可知索拉非尼对细胞增殖能力的抑制作用强于阿帕替尼。细胞划痕实验结果显示：索拉非尼组、阿帕替尼组的细胞迁徙面积比率均小于对照组，索拉非尼组的迁徙面积小于阿帕替尼组，同样说明索拉非尼对肝癌细胞迁移的抑制作用大于阿帕替尼。ELISA实验检测结果显示索拉非尼组、阿帕替尼组的VEGF、TNF-α及IL-6的含量均小于对照组；索拉非尼组的VEGF、TNF-α及IL-6的含量均小于阿帕替尼，表明索拉非尼对细胞因子的抑制能力强于阿帕替尼，在抗血管活性方面，索拉非尼较阿帕替尼有明显的优势。综上所述，索拉非尼、阿帕替尼都对人肝癌SMMC-7721细胞的增殖、迁移、细胞因子有抑制作用，索拉非尼作用强于阿帕替尼。

[1]Fong Z V, Tanabe K K. The clinical management of hepatocellular carcinoma in the United States, Europe, and Asia: a comprehensive and evidence-based comparison and review [J]. Cancer, 2014, 120（18）: 2824-2838. DOI:10.1002/cncr.28730.

[2]LencioniR, Petruzzi P, Crocetti L. Chemoembolization of hepatocellular carcinoma [J]. Semin Intervent Radiol, 2013,13（9 pt 2）: S211-S221.

[3]Bruix J, Raoul J L, Sherman M, et al. Efficacy and safety of sorafenib in patients with advanced hepatocellular carcinoma:subanalyses of a phase III trial [J]. J hepatol, 2012, 57（4）:821-829. DOI: 10.1016/j.jhep.2012.06.014.

[4]Zhang H. Apatinib for molecular targeted therapy in tumor[J]. Drug Des Devel Ther, 2015, 9（11）: 6075-6081. DOI:10.2147/DDDT.S97235.

[5]Meinhardt G, Bruix J, Llovet J, et al. Analysis of tumor growth rate for advanced hepatocellular cancer patients receiving placebo or sorafenib in the phase 3 SHARP and Asia Pacific trials [J]. Ann Oncol, 2016, 27（suppl 6）: 704P.

[6]Okita K, Kumada H, Ikeda K, et al. Phase Ⅰ/Ⅱ study of E7080（lenvatinib）, a multitargeted tyrosine kinase inhibitor, in patients（ pts） with advanced hepatocellular carcinoma（ HCC）:initial assessment of response rate [J]. J Clin Oncol, 2012, 30（4_suppl）: 320. DOI: 10.1200/jco.2012.30.4_suppl.320.

[7]Romano F, Nespoli S, Garancini M, et al. Critical aspects in the management of HCC: Indications to hepatic resection according to BCLC system [J]. HPB, 2016, 18（2）: e702.DOI: 10.1016/j.hpb.2016.01.108.

[8]Cheng A L, Guan Z, Chen Z, et al. Efficacy and safety of sorafenib in patients with advanced hepatocellular carcinoma according to baseline status: subset analyses of the PhaseⅢsorafenib Asia–Pacific trial [J]. Eur J Cancer, 2012, 48（10）:1452-1465. DOI: 10.1016/j.ejca.2011.12.006.

[9]祝普利,尹 超,冯建龙.原发性肝癌综合治疗进展[J].临床肝胆病杂志, 2015, 31（6）: 965-968. DOI: 10.3969/j.issn.1001-5256.2015.06.034.

[10]Peng H, Zhang Q, Li J, et al. Apatinib inhibits VEGF signaling and promotes apoptosis in intrahepatic cholangiocarcinoma [J].Oncotarget, 2016, 7（13）: 17220-17229. DOI: 10.18632/oncotarget.7948.

[11]Peng S, Zhang Y, Peng H, et al. Intracellular autocrine VEGF signaling promotes EBDC cell proliferation, which can be inhibited by Apatinib [J]. Cancer Lett, 2016, 373（2）: 193-202. DOI: 10.1016/j.canlet.2016.01.015.

[12]Zhu Y, Cheng Y, Guo Y, et al. Protein kinase D2 contributes to TNF-α-induced epithelial mesenchymal transition and invasion via the PI3K/GSK3β/β-catenin pathway in hepato cellular carcinoma [J]. Oncotarget, 2016, 7（5）: 5327-5341.DOI: 10.18632/oncotarget.6633.

[13]Ikeda K, Kudo M, Kawazoe S, et al. Phase 2 study of lenvatinib in patients with advanced hepatocellular carcinoma[J]. J Gastroenterol, 2017, 52（4）: 512-519. DOI: 10.1007/s00535-016-1263-4.

[14]Li J, Qin S, Xu J, et al. Apatinib for chemotherapy-refractory advanced metastatic gastric cancer: results from a randomized,placebo-controlled, parallelarm, phase Ⅱ trial [J]. J Clin Oncol，2013, 31（26）: 3219-3225. DOI: 10.1200/JCO.2013.48.8585.

[15]Hu X, Cao J, Hu W, et al. Multicenter phase Ⅱ study of Apatinib in non-triple-negative metastatic breast cancer [J]. BMC Cancer,2014, 7（14）: 820. DOI: 10.1186/1471-2407-14-820.

[16]秦叔逵，李 进.阿帕替尼治疗胃癌的临床应用专家共识[J]. 临床肿瘤学杂志，2015（9）: 841-847.