Hedgehog通路抑制剂HhAntag的合成

顾寿胜

（1.江南大学药学院,江苏 无锡214122;2.润泽制药（苏州）有限公司,江苏 苏州 215126）

Hedgehog通路抑制剂HhAntag的合成

顾寿胜1,2

（1.江南大学药学院,江苏 无锡214122;2.润泽制药（苏州）有限公司,江苏 苏州 215126）

在许多人体组织中，Hedgehog (Hh)信号通路的配体依赖性激活与肿瘤发生相关联，具有抗肿瘤活性，而HhAntag是GLi1介导的转录抑制剂，是一种Hedgehog信号通路拮抗剂。本文介绍了以5-氯-2-硝基苯胺为原料通过四步反应合成Hedgehog通路抑制剂HhAntag（N-[4-氯-3-[5-(二甲基氨基)-1H-苯并咪唑-2-基]苯基]-3,5-二甲氧基苯甲酰胺）。

Hh信号通路抑制剂；N-[4-氯-3-[5-(二甲基氨基)-1H-苯并咪唑-2-基]苯基]-3,5-二甲氧基苯甲酰胺；合成

Hedgehog（Hh）信号通路主要由配体 Sonic hedgehog ( Shh)、膜受体Patched (Ptch )、信号开关蛋白Smoothened(Smo )及下游的转录因子Gli 组成。国内已有报道的Hh信号通路的抑制剂有以Smo为靶点的小分子抑制剂：环杷明 (cyclopamine )及vismodegib(GDC-0449)，在抑制Hh通路的活性方面，已证实HhAntag比cyclopamine强效约10倍。观察到对HhAntag一定范围的细胞敏感性，作用于生长抑制的IC50值范围是2μM到30μM。鉴于Hh信号在多种肿瘤适应症的治疗中存在着较大的潜力,因此开发全新结构的Hh抑制剂具有重要临床意义[1～7]。Hhantag 化 学 名 称 为 N-(4-chloro-3-(5-(dimethylamino)-1H-benzo[d]imidazol-2-yl)phenyl)-3,5-dimethoxybenzamide， 分 子 式24H23ClN4O3， 相对分子质量450.92，CAS登记号为496794-70-8。化学结构式见图1。

而在专利[10]文章中提及图3合成路线以邻苯二胺为原料与2-甲基-5-硝基苯甲酸在多聚磷酸条件下高温反应环合得到2-（2-甲基-5-硝基苯）-1H苯并咪唑化合物，再以甲苯、醋酸条件中125度反应1hr进行硝基还原反应，最后进行酰胺反应链接R3基团。

在专利文章[8][11]中提到化合物中间体3的合成路线如图2所示：以2-硝基苯胺为原料溶于乙腈中，滴入2-氯-5-硝基苯甲酰氯的乙腈溶液，反应在N2保护下控制滴加时反应温度在25度以内，滴完后升温至75度反应1hr。反应降温至0度过滤，产品用冷乙腈洗涤得到淡黄色产品，收率50%。将化合物2溶于乙醇并升温至40度，分三批将氯化亚锡和盐酸投入反应中，逐步将反应温度升至80度并搅拌反应2h。将反应降至0度后滴入1N的氢氧化钠溶液将PH调12-13，反应不超过10度，反应液用水稀释后乙酸乙酯萃取，有机层合并后洗涤干燥旋干得到粗品，二氯甲烷/甲醇（60：1）柱层析得到中间体3-(1H-苯并咪唑-2-基)-4-氯-苯胺，收率68%。

专利[10]文章中相似结构中间体的合成路线如图4：以邻硝基苯胺为原料与2-氯-5-硝基苯甲酰氯在二氯甲烷体系中进行酰胺反应，接着以铁粉为还原剂在乙酸体系中还原并和环，再进行酰胺反应链接R3基团。

此专利也提及另一种以对氰基邻苯二胺为原料与2-甲基-5-硝基苯甲酸在醋酸条件中反应获得中间体过渡态再经升温环合生成2-(2-氯-5-硝基苯基)-5-氰基苯并咪唑化合物如图5；

专利[9]文章中相似结构中间体的合成路线如图6：

此专利[9]所涉及的合成路线与专利[10]中路线图4相似，以邻硝基苯胺结构的原料与2-氯-5-硝基苯甲酰氯在二氯甲烷体系中进行酰胺反应，接着以锌粉为还原剂在乙酸体系中还原两个硝基并关环生成关键中间体。

而HHantag结构中二个甲基的形成可参考图7第一种合成方法：以5-氯-2-硝基苯胺为原料在乙醇体系中与二甲胺反应生成5-二甲基氨基-2-硝基苯胺，具体事例如下：

将5-氯-2-硝基苯胺(4.14 g, 24.0 mmol) 溶于乙醇 (62 ml)中，倒入密封反应管中,加入 40%二甲胺溶液(22.5 ml, 178 mmol, 7.4 eq)，在90°C 油浴中反应2天. 降温后补充40%二甲胺溶液 (7.5 ml)继续加热反应3天. 反应降至室温后，将反应液倒入(250 ml)冰水中.搅拌后过滤，滤饼用水(200 ml)洗涤，减压干燥得到黄色产品5-二甲基氨基-2-硝基苯胺4.16g，收率96%。

第二种合成方法参考专利[9]如图8：酰胺反应，再进行还原环合反应就可以得到中间体2-(5-氨基-2-氯苯基)-5-(N,N-二甲基氨基)-1H-苯并咪唑，再与3,5-二甲氧基苯甲酰氯进行酰胺反应合成得到终产品Hhantag。

1 实验部分

1.1 主要试剂与仪器

2-硝基-5-氯苯胺，2-氯-5-硝基苯甲酸，3,5-二甲氧基苯甲酸，N,N-二甲基甲酰胺，碳酸钾，氯化亚锡，乙醇，二甲胺水溶液，乙腈；核磁氢谱（1H NMR）：Bruker 400、液质联用仪：Agilent 1100、真空干燥箱、旋转蒸发仪、循环水多用真空泵等。

1.2 化合物的合成

将5-氯-2-硝基苯胺(50 g，0.29 mol)溶于乙醇(1.1 L) 投入5L密封反应瓶中，在0-50C快速投入二甲胺盐酸盐(130 g，1.59 mmol) 和三乙胺(260 ml)。反应加热至130oC 压力4bar搅拌20hr. 反应结束后降温减压旋除乙醇，残余溶液滴入2 M 氢氧化钠溶液(1 L) 调PH至碱性，用EA多次萃取，合并有机相后饱和氯化钠洗涤干燥，过滤滤液减压旋蒸得到产品5-二甲基氨基-2-硝基苯胺，收率95%。比较上述两种甲基化的方法收率相近，原料相似但都需要密封体系带压进行反应，不适合工艺化。后经过优化在常压回流状态下改变二甲胺的投料比亦可使反应完全。

综合上述研究资料并通过合成摸索试验，化合物Hhantag的合成设计路线如图9所示由5-氯-2硝基苯胺为原料先进行甲基化反应、

Step 1： 在10L三口反应瓶中加入DMF（6.5L），机械搅拌下加入碳酸钾（1412g 10.2mol）和原料5-氯-2-硝基苯胺（800g 4.65mol），先加入二甲胺水溶液500ml后升温至回流，控制反应温度在100度以上，滴加二甲胺水溶液2000ml。取样检测，如仍有原料未反应继续补加二甲胺水溶液至反应结束。降温，将溶液倒入冰水中，析出产品，过滤，用水多次洗涤滤饼，烘干得到800g产品，收率95%。MS(ESI)(m/z):[M+H]181.19 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.04 (s, 6H), 5.76(d, 1H), 6.12(dd, J = 2.7, 9.8 Hz, 1H), 7.99 (d, J = 9.8 Hz, 1H)。

Step 2： 在10L三口反应瓶中加入5-二甲基氨基-2-硝基苯胺（800g 4.42mol）和ACN溶液6L，室温搅拌下滴加2-氯-5-硝基苯甲酰氯（1065g 4.85mol）的ACN（2L）溶液，滴加完成后升温至80度，反应2hr出现大量固体，中控无原料后冷却，过滤漂洗，烘干得1.4kg产品，收率87%。MS(ESI)(m/z):[M+H]364.74

Step 3： 在10L三口反应瓶中加入原料2-氯-N-（5-（二甲氨基）-2-硝基苯基）-5-硝基苯胺（900g 2.47mol）和乙醇9L搅拌下升温至60度，分批加入SnCl2，将反应温度逐步升至80度，搅拌过夜，检测无原料后降温。置换入大桶中，搅拌下滴加10%的氢氧化钠溶液，控制反应温度10度以下，调PH值至12～13，用EA萃取5次（5L*5）其间补加10%氢氧化钠溶液调节PH。合并有机相，用稀氢氧化钠溶液和饱和食盐水洗涤后无水硫酸钠干燥，浓缩过滤得到产品460g，收率65%。MS(ESI) (m/z):[M+H]286.76。

Step 4： 在10L三口反应瓶中加入2-（5-氨基-2-氯苯基）-5-(N，N-二甲基氨基)-1H-苯并咪唑（800g 2.8mol）和5L CH2Cl2溶液，室温搅拌下滴加3,5-二甲氧基苯甲酰氯（740g 3.36mol）的CH2Cl2溶液，滴完搅拌过夜。中控分析无原料后过滤，滤饼用CH2Cl2洗涤，得产品N-[4-氯-3-[5-(二甲基氨基)-1H-苯并咪唑-2-基]苯基]-3,5-二甲氧基苯甲酰胺1.3kg，收率96%,HPLC 95%。MS(ESI)(m/z): [M+H]450.92;1HNMR(400MHz,CDCl3)8.426 (s, 1H), 8.316 (m, 1H), 8.221 (m, 1H), 7.46(s, 1H), 7.546(m, 1H), 7.419 (m, 1H), 7.031 (m, 2H), 6.885 (m, 2H), 6.610 (m,1H), 3.840 (s, 6H), 2.993 (s, 6H)。

中间原料2-氯-5-硝基苯甲酰氯以2-氯-5-硝基苯甲酸为原料与氯化亚砜回流反应完成后旋除多余氯化亚砜得到所需的对应酰氯，再与4-氨基-N,N-二甲基-3-硝基苯胺进行下一步酰胺化反应。而3,5-二甲氧基苯甲酰氯以3,5-二甲氧基苯甲酸为原料与氯化亚砜回流反应完成后旋除多余的氯化亚砜得获得所需的3,5-二甲氧基苯甲酰氯；再与环化中间体2-（5-氨基-2-氯苯基）-5-(N，N-二甲基氨基)-1H-苯并咪唑进行酰胺反应得到终产品并进行结晶纯化。

2 结语

整个合成设计路线以5-氯-2-硝基苯胺原料经过第一步常压甲基化反应、第二步酰胺反应、第三步还原环合反应、第四步酰胺反应后合成获得终产品HhAntag。通过对原有参考文献工艺进行改进优化，简化了合成路线从原料经过四步反应即可合成N-[4-氯-3-[5-(二甲基氨基)-1H-苯并咪唑-2-基]苯基]-3,5-二甲氧基苯甲酰胺，此方法经优化后适合在实验室进行放大，且并未采用三废较多的铁粉还原，不需要使用高压设备可生产获得公斤级产品，为工业化生产打下了基础。

[1]张连第,辛敏行,文珺等.4-(嘧啶-2-氨基)苯甲酰胺衍生物的设计、合成及 Hedgehog信号通路抑制研究[J].有机化学,2014(34):1407-1416

[2]武玉杰,李京敏,王东.Hedgehog信号通路与肿瘤[J].滨州医学院学报,2010(03):201-203

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[4]HhAntag,a Hedgehog Signaling Antagonist, Suppresses Chond-rogenesis and Modulates Canonical and Non-Canonical BMP Signaling.

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[6]Yandong Shi,Ubiratan Moura,Isabelle Opitz,Alex Soltermann,Hubert Rehrauer,Svenja Thies,Walter Weder, Rolf A.Stahel1,and Emanuela Felley-Bosco Role of Hedgehog Signaling in Malignant Pleural Mesothelioma.

[7]Dongsheng gu, Kelly E Schlotman, Jingwu Xie Deciphering the role of hedgehog signaling in pancreatic cancer pressure[8]Hedgehog antagonists having zinc binding moieties，US2014018368A1。

[9]Mediators of Hedgehog Signaling Pathways, Compositions and Uses Related Thereto，WO2006050506A1.

[10] Mediators of Hedgehog Signaling Pathways,Compositions and Uses Related Thereto,WO03011219A2.

[11]Hedgehog antagonists having zinc binding moieties,WO2012094328A2.

10.16640/j.cnki.37-1222/t.2018.01.105