裸鼹鼠血清中免疫球蛋白的分离纯化及含量的检测

程继帅, 袁 征, 杨文静, 李壘辰, 丛 薇, 孙 伟, 柏晓松, 崔淑芳

(1. 第二军医大学实验动物中心, 上海200433; 2. 军事医学科学院, 北京100850;3. 上海市市东医院检验科, 上海200438)

裸鼹鼠血清中免疫球蛋白的分离纯化及含量的检测

程继帅1, 袁 征2, 杨文静1, 李壘辰1, 丛 薇1, 孙 伟1, 柏晓松3, 崔淑芳1

(1. 第二军医大学实验动物中心, 上海200433; 2. 军事医学科学院, 北京100850;3. 上海市市东医院检验科, 上海200438)

目的 利用Protein A亲和层析法分离纯化裸鼹鼠血清免疫球蛋白(Ig), 并检测正常的裸鼹鼠血清中三种Ig(IgG、IgA、IgM)的含量。方法 采集裸鼹鼠外周血血清, 用Protein A亲和层析法纯化血清Ig，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白的纯度，测定其重链、轻链的分子量;利用ELISA试剂盒检测成年裸鼹鼠血清中IgG、IgA、IgM的含量。结果 纯化后的裸鼹鼠血清Ig，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定其重链和轻链的相对分子质量分别为55 000和25 000。雄性成年裸鼹鼠血清中IgG、IgA、IgM含量分别为: 0.153±0.021 mg/mL、0.015±0.003 mg/mL和0.021±0.005 mg/mL; 雌性分别为0.156±0.019 mg/mL、0.012±0.001 mg/mL和0.028±0.001 mg/mL。结论 运用Protein A亲和层析法成功分离纯化裸鼹鼠血清Ig，并测定了血清中三种Ig含量。

裸鼹鼠; 免疫球蛋白(Ig); 分离纯化; 含量

免疫球蛋白(Immunoglobulin，Ig)是指具有抗体活性或者无抗体活性而在化学结构上与抗体相似的球蛋白，存在于动物的血液、组织液及外分泌液中。Ig在动物的免疫和生理调节过程中有着重要的作用。当机体收到病原微生物或毒素入侵时，Ig能够与相应的抗原特异性结合、激活补体、结合细胞并产生多种生物学表达、通过胎盘传递免疫力等, 进而避免外源物对机体造成的损伤[1]。裸鼹鼠是一种常年生活在地下的啮齿类动物, 多分布于非洲肯尼亚、埃塞俄比亚等地。Jarvis教授于1967年首次将裸鼹鼠引进实验室进行封闭饲养，并将其用于科学研究[2]。近半个世纪以来，国内外专家学者针对裸鼹鼠开展了一系列的研究，这些研究多集中于抗肿瘤、长寿、耐低氧、耐疼痛等方面，对其免疫系统的研究报道甚少[3-13]。本中心自2011年由非洲引入裸鼹鼠后，对其开展了大量的研究工作，为我国学者进行裸鼹鼠的各种研究工作提供了动物资源及基础数据等便利条件[14-19]。

本文选用Protein A亲和层析法分离纯化裸鼹鼠血清中Ig并测定其分子量，同时采用ELISA法检测成年裸鼹鼠血清中三种Ig的含量[20]，为进行裸鼹鼠体液免疫的相关研究提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 实验动物

12～16月龄普通级裸鼹鼠30只，雌雄各半，均由第二军医大学实验动物中心[SCXK(沪)-2012-0003]繁殖，饲养于模拟其野外生存环境的普通级屏障设施内。

1.2 主要试剂与仪器

主要仪器：高速低温离心机(22R Centifuge，Beckman，美国)、电泳仪(PowerPacTM, Bio-rad，美国)、KODAK凝胶成像分析系统(Gel Logic 4000PRO，Carestream Health，加拿大)、洗板机(ELX50, BioTek, 美国)、酶标仪(Eon, Biotech, 美国);主要试剂：预染蛋白Marker购自于美国Thermo公司，IgA(E99-103)、IgM(E99-101)、IgG(E99-131)ELISA检测试剂盒均购自美国Bethyl公司; Protein A柱(732-4201)购自美国Bio-rad公司。

1.3 实验方法

1.3.1 血清样本的收集 眼眶静脉采血, 37 ℃静置1～2 h，8 000 r/min离心10～20 min，收集上清即为血清。血清样品-80℃保存备用。

1.3.2 Ig的分离纯化 配制平衡缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl, pH8.0)和洗脱缓冲液(0.1 mol/L柠檬酸盐缓冲液, pH3.0)。ddH2O 5CV(Protein A柱的体积)洗掉柱内20%乙醇, 控制流速为1 mL/min; 平衡缓冲液5CV(柱体积)平衡柱子, 控制流速为1 mL/min; 平衡缓冲液稀释血清样品后上样, 控制流速为1 mL/min,收集滤过液; 平衡缓冲液2CV洗涤柱子，控制流速为1 mL/min; 洗脱缓冲液2CV洗脱蛋白，控制流速为1 mL/min，收集蛋白样4管，每管预先加入150 μL的1 mol/L Tris碱。收集每一步获得的滤液或蛋白样品, 加入4×上样缓冲液(含β-巯基乙醇)，100 ℃加热10～15 min使蛋白变性。使用SDSPAGE胶试剂盒配制浓度为10%的分离胶和浓缩胶，胶凝后上样。所用蛋白Marker标准分子量为10 000、15 000、25 000、35 000、45 000、55 000、70 000、100 000、130 000、170 000。90 V恒压条件下电泳30 min，使蛋白样品被压缩;调整电压至120 V继续电泳, 使蛋白样品分离, 待溴酚蓝染料到达胶底部停止电泳。电泳后考马斯亮蓝染色SDS-PAGE胶30～60 min, 脱色液(甲醇∶ 水∶乙酸=5∶4∶1)洗脱染料, 待脱色至本底清晰后拍照, 分析步骤中哪步获得的为分离纯化后的Ig。1.3.3 Ig分子量测定 收集分离纯化后得到的Ig样品，加入4×上样缓冲液，100℃加热10～15 min使蛋白变性。配制SDS-PAGE胶，其中分离胶浓度为12% (丙烯酰胺的总质量与胶总体积的质量体积比)，蛋白变性后上样。SDS-PAGE胶电泳过程同上一步。待SDS-PAGE胶脱色至本底清晰后拍照，分析蛋白变性后所得到蛋白的分子量分布情况，确定裸鼹鼠Ig重链和轻链的分子量。

1.3.4 IgG、IgA、IgM含量检测 按照试剂盒说明书操作，标准样品及待测血清稀释后分别加100 μL到96孔检测板中，室温孵育1 h后洗板，再加入100 μL的检测抗体，室温孵育1h后洗板，再加入100 μL 辣根过氧化物酶 (HRP)溶液A，室温孵育30 min后洗板，再加入100 μL TMB显色液，避光室温孵育30 min，加入100 μL终止液终止反应，在反应终止后5 min内用酶标仪在450 nm波长依序检测各孔的吸光度值。采用ELISA Calc软件由标准样检测结果拟合标准曲线，然后并计算待测样品中IgG、IgA、IgM的含量。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 Ig分离纯化

采用Protein A亲和层析柱对裸鼹鼠血清进行分离纯化后, SDS-PAGE电泳结果如图1所示。血清稀释液过柱后得到的滤液、平衡缓冲液洗涤亲和层析柱后得到的滤液均存在较多的蛋白带，相较于裸鼹鼠血清, 只是去除了部分蛋白; 第一次洗脱液中蛋白量很少, 后三次洗脱液中蛋白带多集中于两处，则后三次洗脱液收集的即为纯化后的免疫球蛋白。

2.2 Ig分子量的确定

免疫球蛋白在变性过程中被β-巯基乙醇还原，降解为重链(H链)和轻链(L链) 2个亚单位，在此基础上进行SDS-PAGE垂直电泳，电泳结果如图2所示。亲和层析纯化后的免疫球蛋白图谱均可见分子量约为55 000和25 000的两条主要蛋白带，他们分别代表裸鼹鼠血清Ig的H链和L链，除了H链和L链外，还存在少量的蛋白条带。

2.3 血清中IgG、IgA、IgM含量的检测

用ELISA试剂盒检测不同性别成年裸鼹鼠血清中3种Ig含量(表1)，结果表明雄性和雌性裸鼹鼠血清Ig含量无明显差异(均P＞0.05)。

图1 SDS-PAGE电泳结果图

图2 SDS-PAGE电泳结果图

表1 裸鼹鼠血清中Ig含量测定值 g/L

3 讨论

野外生活的裸鼹鼠终年生活于地下洞穴，洞穴环境阴暗潮湿且通风不良，各种微生物病原菌滋生，尽管生活于这样不利的环境中，裸鼹鼠的寿命可长达20～30年。此外有研究表明，裸鼹鼠细胞对多种有害物质具有很好的抗性[5,21]。推测这可能与其免疫系统的调节功能相关。

根据种系和个体免疫系统的进化、发育和免疫效应机制和作用特征，通常把免疫分为固有免疫和适应性免疫两种类型。适应性免疫是机体获得性、抗原特异性、抗病原微生物感染的高效防御机制。根据其参与成分和功能，适应性免疫应答可分为两种类型: 体液免疫和细胞免疫[22]。体液免疫即以B细胞产生抗体来达到保护目的的免疫机制。体液免疫的关键在于产生高效而短命的浆细胞，由浆细胞分泌抗体清除抗原。因此，Ig的分离纯化是研究体液免疫的基础手段，而其含量的检测将为体液免疫的研究提供基础数据。

Ig分子量很大, 结构复杂, 但其单体结构非常类似，由两种不同的多肽链组成。Ig单体由两条相同的分子量较小的轻链和两条相同的分子量较大的重链组成，重链和轻链由二硫键连接形成一个四肽链分子, 其构象与英语大写字母Y形状类似。分离纯化后的裸鼹鼠Ig经SDS-PAGE电泳，结果表明:裸鼹鼠的Ig分子量重链为55 000, 轻链为25 000, 推算可知裸鼹鼠Ig的单体分子量为160 000。裸鼹鼠Ig具体结构的证实以及基因的克隆都还有待于进一步研究。

血清Ig的测定是检查体液免疫功能最常用的方法。由于病原体可能在身体的各个部位出现，那么Ig也必须存在于各个部位以对抗病原体。IgG在血液和组织液的含量很高，IgM主要存在于血液中，黏膜表面主要的免疫球蛋白是IgA，目前还没有发现由IgD和IgE缺陷所致疾病，所以通常检测IgG、IgM、IgA，这三类Ig就可以代表血清Ig的水平[23]。在本实验中，采用ELISA检测法检测成年裸鼹鼠血清中IgG、IgM、IgA的含量，结果显示成年裸鼹鼠血清中IgG的含量性别间没有差异。有报道[24]，成年BALB/c鼠血清中IgG的含量约为5.5 g/L，IgA的含量约为0.27 g/L，IgM的含量约为0.74 g/L。对比BALB/c小鼠可知，裸鼹鼠血清中Ig含量低。鉴于裸鼹鼠对多种有害物质的抗性，推测在受到抗原刺激时，裸鼹鼠或许能够快速产生体液免疫应答, 分泌大量的抗体，进而清除抗原，保护机体免受损伤，这一推测有待进一步验证。

本实验首次用亲和柱层析分离纯化裸鼹鼠血清中的Ig，建立了一种裸鼹鼠血清Ig分离纯化的方法，并对其分子量及含量进行了测定，为进行裸鼹鼠体液免疫的研究提供了基础数据。

[1] 于小杰, 葛兴芳, 杨亮亮, 等. 野生动物免疫球蛋白的研究进展[J]. 黑龙江畜牧兽医, 2010, 23:48-49.

[2] Edrey YH, Hanes M, Pinto M, et al. Successful aging and sustained good health in the naked mole rat: a long-lived mammalian model for biogerontology and biomedical research[J]. ILAR J, 2011, 52(1):41-53.

[3] O'Riain MJ, Jarvis JU, Faulkes CG. A dispersive morph in the naked mole-rat[J].Nature, 1996, 380(6575):619-621.

[4] Buffenstein R. The naked mole-rat: a new long-living model for human aging research[J]. J Gerontol A Biol Sci Med Sci,2005, 60(11):1369-1377.

[5] Salmon AB, Sadighi Akha AA, Buffenstein R, et al. Fibroblasts from naked mole-rats are resistant to multiple forms of cell injury, but sensitive to peroxide, ultraviolet light, and endoplasmic reticulum stress [J]. J Gerontol A Biol Sci Med Sci,2008, 63(3):232-241.

[6] Seluanov A, Hine C, Azpurua J, et al. Hypersensitivity to contact inhibition provides a clue to cancer resistance of naked mole-rat[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2009, 106(46):19352-19357.

[7] Kim EB, Fang X, Fushan AA, et al. Genome sequencing reveals insights into physiology and longevity of the naked mole rat[J]. Nature, 2011, 479(7372):223-227.

[8] Tian X, Azpurua J, Hine C, et al. High-molecular-mass hyaluronan mediates the cancer resistance of the naked mole rat[J]. Nature, 2013, 499(7458):346-349.

[9] Gorbunova V, Seluanov A, Zhang Z, et al. Comparative genetics of longevity and cancer: insights from long-lived rodents[J]. Nat Rev Genet, 2014, 15(8):531-540.

[10] Mason MJ, Cornwall HL, Smith ES. Ear structures of the naked mole-rat, heterocephalus glaber, and its relatives(Rodentia: Bathyergidae)[J]. PLoS One, 2016, 11(12):e0167079.

[11] Schuhmacher LN, Smith ES. Expression of acid-sensing ion channels and selection of reference genes in mouse and naked mole rat[J]. Mol Brain, 2016, 9(1):97.

[12] Orr ME, Garbarino VR, Salinas A, et al. Extended Postnatal Brain Development in the Longest-Lived Rodent: Prolonged Maintenance of Neotenous Traits in the Naked Mole-Rat Brain[J]. Front Neurosci, 2016, 10:504.

[13] Kogut MH, Chiang HI, Swaggerty CL, et al. Gene Expression Analysis of Toll-Like Receptor Pathways in Heterophils from Genetic Chicken Lines that Differ in Their Susceptibility to Salmonella enteritidis[J]. Front Genet, 2012, 3:121.

[14] 程继帅, 李莉, 肖邦, 等. 裸鼹鼠骨髓巨噬细胞分离培养方法的建立及其功能的初步研究[J]. 实验动物与比较医学,2016, 1:72-75.

[15] 林丽芳, 王洪, 赵善民, 等. 裸鼹鼠生化位点的初步研究[J].实验动物与比较医学, 2013, 33(6):477-480.

[16] 孙伟, 汤球, 赵善民, 等. 裸鼹鼠的人工饲养繁育初步研究[J]. 实验动物与比较医学, 2013, 33(4):296-300.

[17] 张璐, 袁子彦, 赵善民, 等. 裸鼹鼠生长发育指标及主要脏器系数正常参考值测定[J]. 实验动物与比较医学, 2013,33(6):473-476.

[18] 肖邦, 赵善民, 林丽芳, 等. 裸鼹鼠抵抗病毒感染相关机制的初步研究[J]. 实验动物与比较医学, 2014, 34(5):422-427.

[19] 赵善民, 崔淑芳, 裸鼹鼠生物学特性的研究进展[J]. 实验动物与比较医学, 2013, 33(5):400-405.

[20] 李虎, 臧恒昌, 张惠. 人免疫球蛋白G含量检测方法的研究进展[J]. 齐鲁药事, 2012, 31(9):536-538.

[21] Lewis KN, Mele J, Hornsby PJ, et al. Stress resistance in the naked mole-rat: the bare essentials - a mini-review[J].Gerontology, 2012, 58(5):453-462.

[22] 何维, 曹雪涛, 熊思东, 等. 医学免疫学[M]. 北京: 人民卫生出版社, 2005:1-4.

[23] 刘婷婷, 孟飞龙. 抗体多样化及相关免疫系统疾病研究进展[J]. 中国细胞生物学学报, 2016, 38(5):467-478.

[24] 江敬珏, 邵美琪, 韩淑华, 等. 正常小鼠血清中三种免疫球蛋白的检测[J]. 上海实验动物科学, 1989, 9(1):28-31.

Q95-33

B

1674-5817(2017)05-0414-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.05.014

2017-03-18

国家科技支撑计划(2015BAI09B02)与上海市科委基金(15140900200、16140900100、17140900200)联合资助

程继帅(1991-), 女, 硕士生, 研究方向: 实验动物标准化及人类疾病动物模型研究。E-mail: handsome_91@163.com

共同第一作者: 袁征(1972-), 男, 研究方向: 实验动物资源开发。E-mail: 1390115025@126.com

崔淑芳, 教授, 研究方向: 实验动物标准化及人类疾病动物模型研究。E-mail: youngstar_sf@163.com