应用树鼩对硫酸乙酰肝素佐剂的安全性初步评价

李彦涵, 李建芳, 孙 静, 乌美妮, 王海璇, 胡云章

(中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所疫苗研究室云南省虫媒传染病防控研究重点实验室 云南省重大传染病疫苗工程技术研究中心, 昆明 650118)

应用树鼩对硫酸乙酰肝素佐剂的安全性初步评价

李彦涵, 李建芳, 孙 静, 乌美妮, 王海璇, 胡云章

(中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所疫苗研究室云南省虫媒传染病防控研究重点实验室 云南省重大传染病疫苗工程技术研究中心, 昆明 650118)

目的 通过检测佐剂硫酸乙酰肝素(HS)对树鼩皮肤的刺激性反应以及佐剂与甲型肝炎减毒活疫苗(HepA-l)联合免疫树鼩后主要组织器官的病理分析，探讨以树鼩作为动物模型进行安全性评价的可行性。方法 根据给药次数和皮肤是否完整将树鼩随机分组，采用树鼩同体自身左右对比的方法进行皮肤刺激性实验。根据疫苗及佐剂种类将树鼩随机分组，采用皮下免疫方式，免疫后20周取主要组织器官制备病理切片，HE染色，观察主要组织器官病理学特征。结果 佐剂HS单次及多次给药对树鼩完整皮肤组和破损皮肤组的受试部位均不产生红斑、水肿等刺激性变化。与对照组相比， HepA-l免疫组以及HepA-l联合HS免疫组的心、肝、脾、肺、肾及大脑组织病理观察，均未见明显异常。结论 证实了以树鼩作为动物模型进行疫苗安全性评价的可行性，为以后疫苗及药物评估平台建设提供了基础数据。

树鼩; 硫酸乙酰肝素(HS); 甲型肝炎减毒活疫苗(HepA-l); 皮肤刺激性实验; 病理分析;安全性评价

树鼩(Tupaia belangeri, Tree shrew)是一种生长于热带和亚热带地区的接近灵长类动物的小型哺乳类动物，具有体型小、比较容易饲养及在生物进化史上更接近人类等优点，早在1970、1980年代就用于医学实验研究[1-3]。因此以树鼩作为人类重大疾病研究的动物模型[4-6], 在医学生物学上已呈现出广阔应用前景[7-10]。目前国内外对疫苗安全性评价大多选用大鼠、小鼠或灵长类动物模型，而以树鼩作为动物模型对疫苗进行安全性评价却缺乏报道，制约了树鼩作为标准化动物模型的建立。

本实验观察佐剂硫酸乙酰肝素(heparan sulfate,HS)对树鼩皮肤的刺激反应，并将甲型肝炎减毒活疫苗(Hepatitis A virus attenuated live vaccine, HepA-l)与HS联合对树鼩进行免疫，免疫后解剖树鼩取主要组织器官进行组织病理学检查，为树鼩作为动物模型进行疫苗免疫或安全性评价提供病理学方面的指标，并为树鼩标准化模型的建立完善数据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

普通级成年雄性树鼩, 体质量130～160 g, 来源于中国医学科学院医学生物学研究所树鼩种质资源中心[SCXK(滇)K2013-0001]。所有相关操作均按照医学生物学研究所动物实验伦理委员会要求进行, 动物饲养设施符合相关标准[SYXK(滇)K2014-0007]。

1.2 疫苗及佐剂

HepA-l, 甲型肝炎病毒(HAV)抗原滴度256 EU/mL,由中国医学科学院医学生物学研究所提供；HS(1 mg/mL)购自美国Sigma公司。

1.3 皮肤刺激性实验

1.3.1 实验动物及分组 选取健康树鼩16只, 随机分为单次给药组和多次给药组, 每组各8只, 其中单次给药完整皮肤组、单次给药破损皮肤组、多次给药完整皮肤组以及多次给药破损皮肤组各4只。

1.3.2 树鼩皮肤准备 各组树鼩在实验前24 h采用质量分数6%硫化钠水溶液脱毛，去除树鼩背部脊柱两侧毛发，每侧脱毛面积为20 cm2左右，脱毛后观察皮肤是否有损伤，若无损伤则作为完整皮肤组继续实验; 破损皮肤组用灭菌针尖将去毛消毒皮肤划破，以见有渗血为度[11,12]。

1.3.3 单次皮肤刺激实验 根据分组每只树鼩采用同体自身左右对比，背部去毛区左侧涂HS 50 μg，右侧涂0.5 mL生理盐水作为对照，给药部位用一层油纸外加两层纱布包裹固定，6 h后用温水去除残留涂抹物，之后1h、24 h、48 h、72 h肉眼观察，记录给药部位红斑及水肿情况，按评分标准判断刺激强度。

1.3.4 多次给药皮肤刺激实验 按单次皮肤刺激实验方法, 6 h后去除固定, 每日给药1次, 连续1周,末次去除涂抹物后1 h、24 h、48 h、72 h肉眼观察，记录给药部位红斑及水肿情况，按评分标准判断刺激强度。

1.3.5 皮肤刺激性反应评分标准 以皮肤出现红斑、水肿等为评价指标。无红斑分值为0，轻度红斑分值为1，中度红斑分值为2，重度红斑分值为3，紫红色红斑到轻度焦痂形成分值为4。无水肿分值为0，轻度水肿分值为1，中度水肿分值为2，重度水肿分值为3，严重水肿分值为4。并根据红斑和水肿的积分制计算皮肤刺激强度, 公式为: 每组动物平均分值=Σ红斑和水肿积分/每组动物数[11-13]。

1.4 树鼩经疫苗及佐剂免疫后的组织病理学检查

1.4.1 疫苗与佐剂使用剂量及制备 本实验室前期以小鼠为模型摸索出单独免疫HepA-l合适使用剂量是18EU, HS合适使用剂量是100 μg[14]。将疫苗与佐剂混合后, 在漩涡振荡仪上剧烈震荡混匀, 备用。

1.4.2 动物分组及免疫 将24只成年健康雄性树鼩分为HepA-l免疫组、HepA-l联合佐剂HS组以及空白对照组，免疫途径为皮下免疫，每组8只，免疫后20周取材进行组织病理学检查。检测前树鼩禁食禁水12～14 h，戊巴比妥(50 mg/kg)腹腔注射麻醉后，股动脉放血处死。立即解剖取脑、肝脏、肾脏、心、肺等各组织标本用体积分数10%中性甲醛溶液固定72 h以上。用全自动脱水机脱水透明，常规石蜡包埋，全自动染色机HE染色、封片[15]。在光学显微镜下进行病理组织学检查。

2 结果

2.1 佐剂HS对树鼩皮肤刺激

2.1.1 单次刺激 佐剂HS 对树鼩单次给药完整皮肤组和破损皮肤组的受试部位均无红斑、水肿等刺激性变化，除破损皮肤组1 h的平均分值为0.25外其余均为0，表明佐剂HS单次给药对树鼩的皮肤没有刺激性(表1)。

2.1.2 多次刺激 佐剂HS 对树鼩多次给药完整皮肤组和破损皮肤组的受试部位均无红斑、水肿等刺激性变化, 除完整皮肤组1 h的平均分制为0.25以及破损皮肤组1 h的平均分值为0.5外，其余均为0，表明佐剂HS多次给药对树鼩的皮肤无明显刺激性(表 2)。

2.2 树鼩经疫苗及佐剂免疫后的组织病理学检查

实验期间各组树鼩体质量、毛色均正常，未出现蜷缩、竖毛、搔鼻、抽搐、痉挛、水肿及休克等异常反应，各组树鼩注射部位均未出现红肿、结节，进食、水、粪便和精神等均正常。

树鼩经HepA-l以及HepA-l联合佐剂HS免疫后，主要组织器官的病理切片与空白对照组相比，未见明显异常的病理学改变，说明甲肝疫苗联合佐剂免疫树鼩具有良好的安全性(图1)。

3 讨论

树鼩是在进化中处于食虫类和灵长类之间，接近灵长类的小型哺乳动物。由于其具有体型小、寿命较长等特点，在生理机能、生化代谢和基因组的相似性方面比大鼠、小鼠等实验动物更接近于人，现已广泛应用于医学研究[16-18]。目前国内外对于疫苗评价大多选用小鼠或者灵长类动物模型，各种检测技术都比较成熟，但目前还尚未有树鼩作为动物模型进行疫苗安全性评价的相关报道。

本实验以树鼩为动物模型，观察佐剂HS对树鼩皮肤的刺激反应，并将HepA-l疫苗与HS联合对树鼩进行免疫，免疫后解剖树鼩分析各主要组织器官的病理学切片，完成佐剂安全性的初步评价。

表1 佐剂HS单次给药对树鼩皮肤刺激的测定结果(n=4)

表2 佐剂HS多次给药对树鼩皮肤刺激的测定结果 (n=4)

HS是一类广泛分布于细胞外基质的糖胺聚糖，当细胞外基质发生炎症或损伤时，降解为可溶性低分子量HS[19]。HS作为免疫佐剂能增强以小鼠为动物模型的体液免疫应答，并且对于以乙型肝炎病毒亚单位为抗原的体液免疫增强效应优于铝佐剂或与铝佐剂相当[20]。以佐剂HS作为涂抹物检测树鼩完整皮肤和破损皮肤的刺激性，实验结果表明，佐剂HS 对树鼩单次及多次给药完整皮肤组和破损皮肤组的受试部位均无红斑、水肿等刺激性变化。另外, 本实验对树鼩进行HepA-l以及HepA-l联合HS免疫后，分别于末次免疫后的4周、8周、12周、16周和20周尾静脉采血，用ELISA法检测了树鼩血清中的特异性IgG抗体水平。研究结果表明，除空白对照组外，其余组均在末次免疫的第四周检测到抗-HAV抗体，并且抗体水平随着免疫时间延长而逐渐升高，于第12周达到峰值，此后逐渐下降[21]。说明以树鼩作为动物模型进行疫苗检测是可行的，树鼩可以对疫苗产生良好的免疫应答，体液免疫效果复合研究预期[21]。甲型肝炎减毒活疫苗HepA-l自1992年在我国大规模推广应用至今已有10余年，为预防甲型肝炎的传播发挥了巨大的作用。文献报道[22,23]以猕猴等灵长类为动物模型进行HepA-l的安全性评价，结果表明实验动物在接种免疫后，无接种部位和全身异常反应，肝组织在观察全程无病理改变，尸检均未见甲肝病变。 本实验以树鼩作为动物模型进行HepA-l免疫后， HepA-l免疫组以及HepA-l联合HS免疫组的心脏、肝脏、脾、肺、肾及大脑病理切片与对照组相比，均未见明显病理学改变，研究结果与用灵长类动物模型进行安全性评价得出的结果一致。

研究表明, HS作为佐剂具有良好的安全性, 并且结果提示以树鼩作为动物模型进行疫苗及佐剂的安全性评价是可行的。综上所述, 本实验初步证实了以树鼩作为动物模型进行疫苗评价的可行性, 为以后疫苗及药物实验评价平台的建设提供了基础数据。

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图1 树鼩主要器官组织病理学观察

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Safety Evaluation on Adjuvant Heparan Sulfate in Tree Shrew

LI Yan-han, LI Jian-fang, SUN Jing, WU Mei-ni, WANG Hai-xuan, HU Yun-zhang
(Institute of Medical Biology, Chinese Academy of Medical College and Peking Union Medical College,Yunnan Key Laboratory of Prevention & Control on Insect Infectious Disease, Yunnan Research Center of Engineering Technique for Vaccines against Severe Infectious Diseases, Kunming 650118, China)

ObjectiveTo explore the feasibility of tree shrew as an animal model for safety evaluation,through the detection of adjuvant heparan sulfate (HS) of the tree shrew skin irritation and adjuvant with Hepatitis A virus attenuated live vaccine (HepA-l) combined with immune pathological analysis of main organs on tree shrews.MethodsAccording to the dose frequency and skin integrity, the tree shrews were randomly divided into two groups, the skin irritation test performed by tree shrew own left and right contrast. According to the vaccine and adjuvant type the tree shrews randomly divided, subcutaneous immunization. Twenty weeks after immunization, major organs are harvested to make pathological slice and perform HE staining analysis.ResultsThe skin irritation test of adjuvant HS on tree shrews were no erythema, edema and other irritating changes of single and multiple dosing group on integrity skin or damaged skin. There is no significant pathological change between HepA-l and HepA-l combined with HS group on heart, liver, spleen, lung and kidney and the brain biopsy.ConclusionThe experiment proved that the tree shrew as an animal model for vaccine safety evaluation is feasible, provide the basical data for future vaccine and drug evaluation platform.

Tree shrew; Heparan sulfate(HS); Hepatitis A virus attenuated live vaccine(HepA-l);Skin irritation test; Pathological analysis; Safety evaluation

Q95-33

A

1674-5817(2017)05-0390-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.05.009

2017-03-09

国家科技支撑计划项目(2014BAI01B01); 国家重点研发计划项目(2016YFC1202305)

李彦涵(1982-), 女, 硕士, 助理研究员, 研究方向: 疫苗研发。E-mail: 110393273@qq.com

胡云章(1962-), 男, 教授, 博士生导师, 主要从事病毒疫苗方面的研究。E-mail: huyunzhangym@126.com