超促排卵后不同取卵时间对昆明小鼠卵子质量、体内成熟率和体外受精率的影响

彭礼繁, 张小建, 廖梅旭, 李晓洁, 余 鲲

(四川省人民医院城东病区 辅助生殖医学中心, 成都 610072)

超促排卵后不同取卵时间对昆明小鼠卵子质量、体内成熟率和体外受精率的影响

彭礼繁, 张小建, 廖梅旭, 李晓洁, 余 鲲

(四川省人民医院城东病区 辅助生殖医学中心, 成都 610072)

目的 提高超促排卵KM小鼠卵子质量、体内成熟率和体外受精率。方法 对100只KM小鼠进行超促排卵，并观察超促排卵后获得卵子的卵核与第一极体位置及卵周隙变化、卵子形态、卵子体内成熟率和体外受精率。结果 注射人绒毛膜促性腺激素 (hCG)后12 h、14 h取卵，卵子质量最好; 注射hCG后13 h所取卵的体内成熟率和体外受精率最高。结论 KM系小鼠体外受精的最佳取卵时间为超促排卵后13 h。

小鼠; 超促排卵; 取卵时间; 卵子质量; 体内成熟率; 体外受精率

近年来，许多研究者[1～4]相继报道了关于各品系实验小鼠的保种方法。其中利用胚胎冷冻方法对基因工程小鼠、自然突变模型小鼠和部分稀有品系小鼠进行保种，不失为一种方便、经济的技术。该方法既省去了保种所需的大量资金和空间，又避免了动物饲养和繁衍所带来的繁琐劳作。最重要的是，这种方法保证了每一个动物品系原有的遗传学性状，并免受自然灾害、微生物感染和环境变化所带来的“灭顶之灾” 。要使小鼠的胚胎保种取得较高经济效益，关键之一在于从最少的动物个体中获得最多的可利用胚胎，那么超促排卵-体外受精就是一种切实可行的方法。影响体外受精成功率的因素如培养液、动物年龄、超促排卵、精子质量等，其中最先涉及到的就是超促排卵和取卵。要获得大量的具有受精能力的成熟卵母细胞，其关键在于超促排卵的激素剂量和取卵的时间，这些直接影响到体外受精的效率[2]。本文就小鼠超促排卵后的不同取卵时间对卵子质量、体内成熟率和体外受精率的影响进行比较分析。

1 材料与方法

1.1 动物来源

30日龄清洁级雌性KM小鼠100只，14周龄雄性KM小鼠10只，均购自四川省人民医院实验动物中心[SCXK(川)2014-0017]; 动物饲养于屏障饲育室[SYXK(川) 2013-0102]，室温25～28℃，相对湿度70%，自由采食及饮水。

1.2 仪器与试剂

CO2培养箱(B5060UV,英国RSBiotech公司); 倒置显微镜及显微操作系统(DMIRB, 德国 徕卡公司);荧光显微镜(VANOX 1000X, 日本 Olympus公司); 生物显微镜附照相系统(JVC KY-1900E, 日本Olympus公司); 35 mm培养皿(Faclon, 美国Corning公司); 移液器、矿物油(瑞典Vitrolife公司); 人输卵管液(HTF); M16和 M2胚胎培养液(自配); 孕马血清促性腺激素(PMSG)和人绒毛膜促性腺激素(hCG)均购于宁波第二激素厂。

1.3 方法

1.3.1 分组 将30日龄KM雌鼠分别随机分成20组,每组各5只。14周龄雄性KM小鼠分别随机分成2组,每组各5只。

1.3.2 超促排卵与取卵 每只小鼠腹腔注射PMSG 5 IU，间隔48 h后再腹腔注射hCG 5 IU，其后12～18 h内按间隔1 h分组依次取卵，取得的卵母细胞移入200 μL HTF微滴中培养。

1.3.3 体内成熟率的观察 超促排卵后的卵母细胞排出第一极体作为成熟的标志[成熟率(%)=排除第一极体卵数/总卵数]。

1.3.4 精子的获取与体外受精 按照彭礼繁等[16]方法获得小鼠的精子，放入预先平衡过夜的受精液滴中。培养箱箱孵育5 min后，取10～30 μL精子悬液，移入另一新鲜液滴，调整精子浓度达1.0×106个/mL，培养条件为37 ℃，体积分数6%CO2、体积分数5%N2、饱和湿度，获能5～7 h[17～19]。1.5 h后选择浓度适中、活力佳的精子悬液进行体外受精。将授精的卵母细胞团放在CO2培养箱中培养，6 h后洗卵，再培养过夜。

1.3.5 受精结果的检查 受精培养12 h后将卵子移出，放入含体积分数0.1%透明质酸酶的M2中，用移液枪进行小心反复吹打以去除附着在卵子周围的卵丘细胞，然后用M2再洗5～6遍。将去除卵丘细胞的裸卵放在显微镜下观察，凡见到2原核、第二极体及胞质或卵周隙中有精子尾的均判断为受精。整个洗卵过程中所用洗卵液均为37 ℃预热，操作过程要迅速，尽量减少卵母细胞在外周环境中的停留时间。最后移入预先过夜平衡的M16中培养，24 h后观察2细胞发育情况、2-细胞胚胎数、未受精卵数、异常卵数和取卵总数，统计受精率和异常卵比例，同时观察细胞形态。

1.3.6 卵核的观察 从壶腹部收集的体内成熟卵母细胞，放入质量分数3%的蔗糖溶液中5 min后，在倒置显微镜下观察到折光性不同的区域为卵核所在位置[16]。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 注射hCG后不同取卵时间对卵核与第一极体位置及卵周隙变化的影响

从表1中可以看到，注射hCG后12 h、14 h取卵时，卵核与第一极体在0～30°区域毗邻的卵母细胞率(91.3%、91.5%)显著高于其它处理组(P＜0.05); 注射hCG后20 h、22 h取卵时，卵核与第一极体在30～90°区域毗邻的卵母细胞率(40.8%、42.3%)显著高于其它处理组(P＜0.05); 注射hCG后24 h、26 h取卵时, 卵核与第一极体在90～180°区域毗邻的卵母细胞率(63.4%、61.7%)显著高于其它时间段(P＜0.05)。从注射hCG后10 h取卵时的10.1μm, 增加到26h取卵时的19.9 μm。可见, 注射hCG后12 h至14 h取卵, 卵子质量最好。

2.2 注射hCG后不同取卵时间对KM小鼠的卵子体内成熟率和体外受精率的影响

由表2结果可以看出，在超促排卵后13 h取卵的体内成熟率和受精率最高；13 h异常卵比例最低，而18 h受精率最低、异常卵比例最高。KM小鼠超促排卵后不同取卵时间的体外受精率均呈现相同的趋势: 随着取卵时间的提前或延迟，受精率逐渐降低。观察异常卵的形态，可见在超促排卵后14 h取的卵中，异常卵均为发育异常。超促排卵后13 h取的卵细胞较多，12 h取的卵细胞最少。

表1 注射hCG后不同取卵时间对卵核与第一极体位置及卵周隙变化的影响Table 1 Effect of different in vivo maturation time after HCG on location between oocyte caryoplasm and first polar body change of perivitelline space

表2 KM 小鼠的卵母细胞形态和体外受精率的变化Table 2 Morphology of oocytes and IVF rate for KM mouse

3 讨论

在研究第一极体出现与退化时间变化时, 本试验表明，小鼠体内成熟的卵母细胞在注射hCG后10 h时没有第一极体排出, 但到hCG处理后12 h开始有12.8%的第一极体排出, 到hCG处理后14 h第一极体的排出率达到最大, 即91.5%。Alcobia等[2]研究表明, 在注射hCG处理后10～14 h取卵, 小鼠的卵母细胞多数处于第一次减数分裂后期。Alcobia等[3]研究表明, 对于CBA小鼠在注射hCG后11 h取卵时, 大多数卵子都排出第一极体。Armstrong等[4]在注射hCG后14 h取卵，只有约10 %的第一极体开始移动，但到极体排出后2 h，即注射hCG后14 h时，只有10 %的卵核处于第一极体的下方，其余的卵核都分布于卵母细胞的其它区域，这与本试验结果在注射hCG后16 h有70.4 %的第一极体处于0～3 0°区域的结论不同。

Cremer等[5～10]研究表明，体内成熟的卵母细胞中第一极体移动的要比体外成熟的卵母细胞要快。他们认为对于体内成熟的卵母细胞，可能是由于脱卵丘促进了第一极体的移动，因为对于体外成熟的卵母细胞是在脱完卵丘细胞后才进行培养的。极体的移动是一个时间与卵周隙的依赖过程，卵周隙会随着取卵时间的延长而逐渐增大，而卵周隙的增大会促进极体的移动。以下的结果可以证实作者的解释：①体内成熟的卵母细胞在体外老化过程中卵周隙都会在增大，而且卵周隙与极体处于0～30°的比例间具有很高的相关性; ②排卵过程会促进第一极体的移动; ③极体排出后脱卵丘细胞后会促进极体的移动，而老化后脱卵丘细胞会更加促进极体的移动。该过程可能涉及到卵母细胞皮质区的微丝。因此，第一极体的移动可能是由于卵周隙逐渐增大的缘故，本试验结果也证实了该点。

本实验证明, 超促排卵后取卵时间的差异会对体外受精产生显著影响，并直接关系到正常胚胎的获得数。对于小鼠体外受精的取卵时间, 多数文献只给出了一个大致时间范围[11,20]。但从本实验结果可看出，在这些时间范围内取的卵其受精率之间也有着明显差异。超促排卵后13 h、14 h 取卵的两组，受精率最高，且两组间无明显差异(P＞0.05);但结合总取卵数和异常卵比例来看，超促排卵后13 h取卵的异常卵比率最低而且取卵数最多。所以，在超促排卵后13 h取卵进行体外受精是最佳时间，这与左琴等[20]报道是一致的。取卵时间过晚会使受精率大大降低，14 h所取卵的受精率明显高于15 h以后所取的卵(P＜0.01)。因为卵母细胞在体内发育成熟后若不能及时受精便开始衰退，逐渐丧失受精能力。取卵时间过早，获得的卵母细胞中有一部分还未完全发育成熟，受精能力较低，而且在体外培养过程中容易死亡，影响体外受精率。在体外受精过程中会产生部分异常卵，这是由于卵母细胞多精子受精或孤雌发育造成的，实验结果显示这些异常卵对体外受精率并无多大影响。而死亡卵和退化卵则大大影响了体外受精率，只要控制好超促排卵后的取卵时间，它们的产生也是可以避免的[12]。

造成超促排卵效果不稳定的因素主要有三大类:一类是动物因素, 包括开始超促排卵的时间、发情同步方法、遗传因素、营养状态等。因此, 要选择健康、体质量适中的动物。如果雌鼠体质量过大, 不易与雄鼠交配，而雌鼠过小，其发育尚未成熟，超促排卵效果不佳。第二类是药物因素, 包括激素的半衰期、激素种类、激素药效，及激素的比例、给药途径、多种激素的联合应用与剂量、频率等。第三类是影响动物的各种环境因素和人为因素等，如室温应在22～26 ℃，湿度应保持在50%～70%。不适的温湿度条件会影响其配种与受胎率，并影响卵子的数量和质量。配种与胚胎回收方法的选择也对超促排卵效果也有直接影响[14]。

要让体外受精这门胚胎技术在实验动物的保种和转基因动物的繁育上发挥其方便、经济、有效的特性，除了选择培养基、改进操作方法外，严格控制取卵时间也显得尤为重要[15]。控制适当取卵时间是体外受精的关键之一，但在整个实验过程中，依然会遇到一些对受精率有影响的操作环节，例如授精时间、培养液的酸碱度和渗透压、精子浓度和质量等，而且小鼠品系间的差异也会对胚胎实验产生一定的影响，这有待于在今后的实验中做进一步研究。

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Different Oocyte Collecting Time Impact on Quality of Oocyte,in Vivo Maturation Rate and in Vitro Fertilization Rate after Superovulation in KM Mice

PENG Li-fan, ZHANG Xiao-jian, LIAO Mei-xu, LI Xiao-jie, YU Kun
(Reproduction Medical Center, Sichuan Provincial People's Hospital East Ward, Chengdu 610072, China)

ObjectiveTo improve the quality of oocyte,in vivomaturation rate andin vitrofertilization rate in KM mice.MethodsOne-hundred KM mice were super-ovulated, the changes of the oocyte nucleus and the first polar body position, the perivitelline space changes, oocyte morphology,in vivomaturation rates andin vitrofertilization rates were observed and calculated.ResultsThe oocyte quality was best after 12 h、14 h of injection with human chorionic gonadotropins (hCG), and oocyte in vivo maturation rate and in vitro fertilization rate were the highest after 13 h.ConclusionCollection of oocyte after 13 h of superovulation was the best time forin vitrofertilization of KM mouse.

Mice; Superovulation; Collecting oocyte time; Oocyte quality;In vivomaturation rate;In vitrofertilization rate

Q95-33

A

1674-5817(2017)05-0405-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.05.012

2017-04-17

四川省科技厅软科学项目(2017ZR0060)

彭礼繁(1982-), 男, 硕士, 助理研究员, 研究方向: 辅助生殖胚胎学。E-mail: penglf_syau@126.com