转录抑制因子锌指蛋白57在乳腺癌中的表达及意义

郑明洁, 王 水, 陈 列, 马 哿

(南京医科大学附属第一医院 乳腺外科, 江苏 南京, 210029)

转录抑制因子锌指蛋白57在乳腺癌中的表达及意义

郑明洁, 王 水, 陈 列, 马 哿

(南京医科大学附属第一医院 乳腺外科, 江苏 南京, 210029)

目的探讨锌指蛋白57(ZFP57)在乳腺癌中的表达及其与临床病理的相关性。方法应用QPCR及Western Blot方法检测乳腺癌细胞株中ZFP57表达，用QPCR方法检测80例乳腺癌及癌旁组织中ZFP57表达，并分析与临床及病理结果的相关性。结果在5种乳腺癌细胞(MDA-MB-231、SUM1315、T47D、MCF-7以及ZR-75-1)中, mRNA水平ZFP57相对表达量分别是(2.866±0.1986)、(1.000±0.0993)、(6.362±0.2970)、(10.150±0.4218)、(7.8000±0.421)，蛋白水平相对表达量为(2.689±0.0905)、(1.018±0.0561)、(7.044±0.1232)、(9.328±0.2981)、(7.390±0.2332)，差异有统计学意义(P<0.05)。在80例乳腺癌组织中ZFP57的相对表达水平为(0.0558±0.0101)，与癌旁组织中ZFP57的相对表达水平(0.1708±0.0267)比较有显著差异(P<0.05)。临床病理分析结果显示，无淋巴结转移的患者为(0.0707±0.0138)，与有淋巴结转移的患者(0.0209±0.0064)比较有显著差异(P<0.05)。肿块≤2 cm为(0.0957±0.0215), 2～5 cm为(0.0418±0.0111), >5 cm为(0.0198±0.0097)，差异有统计学意义(P<0.05)。结论ZFP57在乳腺癌中表达明显下降，其表达与肿瘤大小以及淋巴结转移程度呈负相关。

锌指蛋白57; 乳腺癌; 淋巴结转移

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率均位于女性恶性肿瘤前列[1]。对乳腺癌相关标志物的预测研究仍是当前研究的热点之一。肿瘤微环境对肿瘤的生物学特性有着重要的调节作用。在前期的研究中，作者建立了人源性乳腺微环境模型，该模型由于具备了组织特异性和种属特异性，更接近于临床，能更好地模拟乳腺癌的增殖和转移[2]。在该模型基础上获得了受到人源性乳腺微环境调控的靶点基因谱，其中锌指蛋白57(ZFP57)在人源性微环境调控下表达明显下调[3]。

ZFP57基因是一种转录抑制因子，定位于6号染色体，ZFP57蛋白由536个氨基酸组成，其中包含一个KRAB域和7个锌指结构，它所包含的KRAB结构域，能够与Trime28结合形成转录抑制复合体，再与启动子区结合以维持基因印记来调控印记基因的转录[4-5]。近年来，国外少量研究[6-7]提示该基因可能与纤维肉瘤、脑胶质瘤具有一定相关性。本研究探讨ZFP57在乳腺癌组织中的表达及临床意义，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 组织标本的收集

选取南京医科大学第一附属医院2015年8月—2016年12月具有完整病例资料的乳腺浸润性导管癌患者的病理组织80例，每例患者手术取切除的乳腺癌组织5 mm ×5 mm ×5 mm, 同时取其距离癌组织边缘2 cm以上的癌旁组织5 mm ×5 mm ×5 mm。详细记录患者的性别、年龄及临床病理特征，患者在手术前未进行任何的放疗或化疗等抗癌治疗。

1.2 细胞培养

本实验使用的细胞株SUM1315由密歇根大学的Stephen Ethier教授惠赠, MDA-MB-231、T47D、MCF-7以及ZR-75-1购自美国标准菌种收藏所(ATCC)，这几株细胞均是目前乳腺癌研究中最常用的细胞株。细胞体外培养时使用的是含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素双抗的DMEM培养基，培养时呈上皮样贴壁生长。

1.3 引物设计合成

用 Primer 5.0软件进行分析设计PCR引物，交由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列如下: β-actin forward: 5′-GCATCGTCACCAACTGGGAC-3′; β-actin reverse: 5′-ACCTGGCCGTCAGGCAGCTC-3′; ZFP57 forward: 5′-CAGAGGGTCCTTTACCAGGAT-3′; ZFP57 reverse: 5′-CTCTCAGACTGGGATGTTGTTC-3′。

1.4 总RNA提取

① 从之前在液氮中取出5 mm ×5 mm ×5 mm的组织，放在EP管中用一次性研磨棒轻轻研磨至匀浆状。同样乳腺癌细胞经胰酶溶解，消化，离心置于EP管中，加入1 mL Trizol试剂，室温静置5 min。② 加入200 μL氯仿，振荡15 s, 室温静置5 min, 在低温高速离心机以4 ℃、12 000 r/min离心15 min。③ 吸取上层液体转至另一新EP管中，加入500 μL异丙醇，混匀后室温静置10 min, 4 ℃、12 000 r/min离心10 min。④ 弃上清，加入1 mL 75%乙醇，置于4 ℃、10 000 r/min离心5 min, 弃上清。⑤加入DEPC处理后的水20～40 μL, 经反复吹打溶解RNA。⑥ 取2 μL抽提的RNA加入98 μL 0.1% DEPC灭活RNA酶的去离子水中。⑦ 用反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA，cDNA可直接用于RNA扩增。

1.5 实时定量荧光PCR

① 每个cDNA样本都稀释10倍(5 μL cDNA + 45 μL H2O)引物mixture(引物的F和R在同一管中)，浓度各为5 pmol/μL。② 上样: 一个样本做3个复孔，用移液器移至96孔板中。反应体系: 2×的RTmix 10 μL; 模板(cDNA稀释10倍)1 μL; 引物F和R各5 pmol/μL mix 2 μL; DEPC 水 7 μL; 共20 μL。③ PCR反应程序: 95 ℃, 10 min; 95 ℃, 10 s, 40个循环; 58 ℃退火，15 s; 72℃延伸，45 s。④ 每个样品做3个副孔，以β-actin基因作为内参。结果以基因的相对表达量即2-△△CT进行比较。

1.6 蛋白印记

分别提取各乳腺癌细胞的总蛋白，用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，上样总蛋白50 μg, 经8%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后，湿转法将凝胶转移到NC膜。将膜用5%脱脂牛奶封闭1 h后加入SNCG一抗(1∶1 000稀释)，置于摇床上4℃孵育过夜。次日，膜用TBST洗涤3次，每次10 min，洗膜后加入二抗(1∶3 000稀释)，再次TBST洗涤3次，每次10 min, 用超敏ECL化学发光试剂(购于Pierce公司)检测蛋白条带，最后用Image J软件对蛋白条带进行灰度分析。

1.7 统计学分析

数据分析采用GraphPad Prism 5.0的统计包，对于两组间的比较，采用了t-检验,P<0.05(双侧)。对于多组数据间的比较采取单因素方差分析,P<0.05(双侧)。使用QPCR检测结果, ZFP57在乳腺癌细胞及临床标本中的相对表达量采用2-△△CT表示。

2 结 果

2.1 ZFP57在乳腺癌细胞中的表达水平分析

QPCR法检测发现，在5种乳腺癌细胞(MDA-MB-231、SUM1315、T47D、MCF-7以及ZR-75-1)中，ZFP57相对表达量分别是(2.866±0.1986)、(1.000±0.0993)、(6.362±0.2970)、(10.15±0.4218)、(7.800±0.6797)，相对于SUM1315，其余4种细胞的表达量均有显著差异(P<0.05)。见图1A。

Western法检测发现，在5种乳腺癌细胞(MDA-MB-231、SUM1315、T47D、MCF-7以及ZR-75-1)中, ZFP57相对灰度值分别是(2.689±0.0905)、(1.018±0.0561)、(7.044±0.1232)、(9.328±0.2981)、(7.390±0.2332)，相对于SUM1315, 其余4种细胞的表达量均有显著差异(P<0.05)。见图1B、C。

图1 ZFP57 在乳腺癌细胞中的表达

2.2 ZFP57在临床组织标本中表达水平分析

QPCR法检测发现, 80例乳腺癌患者的癌组织内ZFP57的相对表达水平为(0.0558±0.0101), 80例乳腺癌患者的癌旁组织ZFP57的相对表达水平为(0.1708±0.0267), 差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

图2 ZFP57 在乳腺癌及癌旁组织中的 相对表达量，* P < 0． 05

2.3 乳腺癌组织中ZFP57表达与临床病理参数的关系

根据不同临床及病理分类，作者发现乳腺癌组织中ZFP57相对表达量在≤50岁患者为(0.0496±0.0101), >50患者为(0.0626±0.0183), 差异无统计学意义(P=0.528)。绝经前患者为(0.0601±0.0121), 绝经后患者为(0.0527±0.0151), 差异无统计学意义(P=0.720)。无淋巴结转移的患者为(0.0707±0.0138), 有淋巴结转移的患者为(0.0209±0.0064), 差异有统计学意义(P=0.023)。肿块≤2 cm为(0.0957±0.0215), 2～5 cm为(0.0418±0.0111), >5 cm为(0.0198±0.0097), 差异有统计学意义(P=0.013)。根据分子分型, Luminal A型为(0.0782±0.0238), Luminal B型为(0.0579±0.0167), HER-2阳性型为(0.0359±0.0165), 三阴性型为(0.0484±0.0164), 差异无统计学意义(P=0.730)。

3 讨 论

本研究中，作者首次探讨了锌指蛋白57(ZFP57)在乳腺癌组织及细胞中的表达情况，结果发现乳腺癌组织中ZFP57的表达水平明显低于癌旁乳腺组织。在与临床及病理的相关性分析中，作者发现ZFP57的表达量与肿块大小及淋巴结转移情况具有显著相关性，肿块较大以及出现淋巴结转移和乳腺癌组织中ZFP57表达量更低。同时，细胞实验的结果显示，在恶性度较低的MCF7中ZFP57表达较高，而在易于转移的MDA-MB-231和SUM1315乳腺癌细胞株中表达较低。以上结果说明了ZFP57在乳腺癌中可能存在抑癌及抑制肿瘤转移的作用。

有研究[4-5]表明, ZFP57基因作为一种转录抑制因子，与Trime28结合形成转录抑制复合体，再与启动子区结合以维持基因印记来调控印记基因的转录。基因印记是指体细胞来源于不同亲代的一对等位基因发生的差异性表达，即机体仅表达来自亲本一方的等位基因，而另一方不表达或很少表达。它是表观遗传学中重要的组成部分。在维持印记基因正常印记中，印记控制区(ICR)起重要作用。印记控制区是一组富含CpG岛的序列，该区域的甲基化水平在两条等位基因中存在差异。当子代细胞同时获得来自父源和母源的等位基因，其中一条表现为高甲基化，而另一条甲基化程度较低，造成这两条等位基因表达的差异[6-8]。这种一方基因高甲基化的形成就与ZFP57密切相关。ZFP57与Trime28结合形成的转录抑制复合体在细胞核内与印记基因的印记控制区相连接，防止DNA的主动去甲基化，同时在甲基转移酶的参与下维持印记基因的父源或母源的高甲基化。当ZFP57表达缺失或下调，其调控的下游印记基因的差异性表达就难以维持，从而造成印记缺失，表达异常[9]。

研究[10]发现，肿瘤中普遍存在印记基因的单等位基因调控缺失(LOI)。在正常组织中，印记基因的单等位基因甲基化，从而使表达处于中等水平。当单等位基因的甲基化无法维持，就会出现双等位基因的普遍低甲基化，导致印记基因高表达。同时研究[11-12]表明多种恶性肿瘤中都存在印记缺失的现象，在病理级别高和更易于转移的肿瘤中印记基因的印记缺失比例更高。本研究发现，乳腺癌中ZFP57的表达较正常组织明显下降，这可能是肿瘤的异质性决定的，来源于不同组织不同器官的肿瘤发生机制均存在差异[13]。由于采用的病例数量有限，本研究仍存在一定的局限性，如作者发现ZFP57的表达与分子分型并无显著相关性，可能在增加样本量的情况下会出现不同的结果。

综上所述，转录抑制因子ZFP57在乳腺癌中表达明显下降，同时其表达与肿瘤大小以及淋巴结转移程度呈负相关的特征。该基因在乳腺癌中表达异常的发现可能成为新的乳腺癌相关标志物，并作为靶点基因运用于乳腺癌的治疗。

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Expressionoftranscriptioninhibitorzincfingerprotein57inbreastcanceranditsclinicalsignificance

ZHENGMingjie,WANGShui,CHENLie,MAGe

(DepartmentofBreastSurgery,TheFirstAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity,Nanjing,Jiangsu, 210029)

ObjectiveTo investigate the expression of zinc finger protein 57 (ZFP57) in breast cancer and its clinical significance.MethodsThe ZFP57 expressions were detected by quantitative real-time PCR(QPCR) and Western Blot technique. And its expressions in breast cancer and para-tumorous tissues in 80 patients were detected by QPCR method, and its correlation with clinical and pathogenic results were explored.ResultsIn these breast cancer cells (MDA-MB-231, SUM1315, T47D, MCF-7 and ZR-75-1), the expression contents of ZFP57 in mRNA level detected by QPCR was (2.866±0.1986), (1.000±0.09928), (6.362±0.2970), (10.15±0.4218), (7.800±0.6797), respectively, (P<0.05), while in protein level was (2.689±0.09051), (1.018±0.05613), (7.044±0.1232), (9.328±0.2981), (7.390±0.2332), respectively, and the differences were statistically significant (P<0.05). The average expression of ZFP57 in breast carcinoma was (0.0558±0.0101), while was (0.1708±0.0267) in para-carcinoma and they showed significant differences (P<0.05). The clinical pathogenic analysis revealed that there were significant differences in the average expression of ZFP57 in breast carcinoma without lymph nodes involvement and with lymph nodes involvement [(0.0707±0.0138) vs. (0.0209±0.0064),P<0.05]. The average expression of ZFP57 in masses smaller than 2 cm was (0.0957±0.0215), was (0.0418±0.0111) in masses between 2～5cm, and (0.0198±0.0097) in masses larger than 5 cm, which showed significant differences (P<0.05).ConclusionThe expression of ZFP57 in breast carcinoma is decreased. And the expression of ZFP57 is negatively correlated with the lymph nodes involvement and the size of masses.

Zinc finger protein 57; breast cancer; lymph node involvement

2017-07-10

国家自然科学基金青年基金资助项目(81702607); 江苏省自然科学基金青年基金资助项目(BK20151023)

R 737.9

A

1672-2353(2017)23-053-04

10.7619/jcmp.201723016