大连市榆叶梅叶斑病的病原菌鉴定

谢 颖，王 晶，姜 华

（1.辽宁师范大学生命科学学院，辽宁 大连 116029； 2.大连森林动物园，辽宁大连 116013）

大连市榆叶梅叶斑病的病原菌鉴定

谢 颖1，王 晶2，姜 华2

（1.辽宁师范大学生命科学学院，辽宁 大连 116029； 2.大连森林动物园，辽宁大连 116013）

榆叶梅（Amygdalus triloba）是绿化美化城市园林的常见树种，具有较高的园林观赏价值和药用价值。但近年来大连市园林中的榆叶梅叶斑病发生较重，因此，查明病因，对症下药，实为迫在眉睫。本文采集了感病叶片，以单斑分离法、分离菌株致病性测定、形态学鉴定及分子生物学鉴定等，对大连市榆叶梅发生的叶斑病进行了病原菌鉴定。结果表明，榆叶梅叶斑病的致病菌为交链孢霉属（Alternaria）的甘蓝长尾交链孢霉［Alternaria brassicae］。

榆叶梅；叶斑病；病原菌鉴定，

榆叶梅（Amygdalus triloba）又叫小桃红，是蔷薇科、李属落叶灌木，既可独栽，又可丛植，广泛用于草坪、公园、庭院的绿化和美化，是园林绿化中早春观花树种之一［1］。其果实内的种子有润燥滑肠，下气利水等功效，可治疗食积气滞、水肿、小便不利等疾病［2］。榆叶梅是城市园林中常见的观赏花木，也是大连市区主栽的绿化美化树种，但近年来发生了较为严重的叶斑病，因此，迫在眉睫的是查明病原，以利于对症防治。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病源

榆叶梅叶斑病感病叶片和健康植株的健康叶片。

1.1.2 试剂和培养基

DNA Marker（DL2000）、TaqDNA 聚合 酶、dNTP、buffer等试剂购于大连TaKaRa公司；引物（Its1和 Its4）合成、DNA测序由生工生物工程（上海）公司完成；马铃薯琼脂培养基（PDA）等。

1.1.3 仪器

灭菌器（YM100Z）、超净工作台（YJ-875）、恒温培养箱（HH.B11）、光学显微镜（OLYMPUS，CX21）、PCR仪（GeneAMP 9700）、凝胶成像系统（GDS8000），等。

1.2 方法

1.2.1 病害调查、症状观察与采样

2016年6～9月，对大连市区内多种园林树木，进行了叶斑病普查。榆叶梅叶斑病较重，故此，采集发病植株的感病叶片，同时采集健康植株叶片作对照。在榆叶梅发病区采用五点取样法［3］，随机选点，每点选5株，每株选东西南北树枝。从发病初期每隔30 d调查1次，统计发病率、病情指数［4］，观察病叶症状。

1.2.2 病原菌单斑分离

采用单斑分离法［5］。取感病叶片在病健交界处剪取典型病斑块，经酒精、无菌水表面消毒后转至PDA培养基上28℃恒温培养，4～5 d后观察菌落生长状况，计算单班分离率。再重新取菌丝尖端置于PDA培养基中28℃下恒温培养，重复操作至分离菌株纯化［6］。

1.2.3 分离菌株致病性测定

制备菌悬液，据科赫法则用针刺法接种［5］，每处理接种5片叶，设对照，3次重复。接种后的叶片置于28℃保湿培养，观察其发病情况。

1.2.4 病原菌鉴定

1.2.4.1 形态学鉴定

肉眼观察菌落特征，菌落正反面颜色、轮纹等；光镜下观察菌丝及孢子特征，分生孢子的大小、形状、孢子梗的有无及膈膜等［6］。

1.2.4.2 分子生物学鉴定

以钢珠法提取致病菌DNA，以琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度，以真菌通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和 ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）对致病菌 rDNA-ITS区进行PCR扩增［7］。PCR扩增产物送至上海生工生物工程公司进行DNA测序。最后，将测得的DNA序列在 NCBI网站进行 blast比对，利用ClustalX软件将测得序列与已报道的相近植物病原菌的序列进行序列对齐和同源性序列的多重排定，用 MEGA5.0软件进行序列分析，邻近法（Neighbor-Joining）构建分子系统发育树。

2 结果与分析

2.1 病害调查及症状观察

2.1.1 病害调查

调查期间为2016年5月～2016年10月。叶斑病一般始发期在6月中旬，发病盛期在8月中旬至9月中旬。榆叶梅的始发期发病率为16%、病情指数为6%，7月中旬至8月中旬病害发展迅速，发病率为33%、病情指数升至27.33%，病害盛发期的发病率为57%、病情指数升至34.33%。

2.1.2 症状观察

榆叶梅叶斑病发病部位随机，且病斑形状不规则、分布无规律；病斑初期褪绿发黄，进而由黄变褐，严重者叶斑处枯死或穿孔，感病叶片变薄，病健交界处未见明显黄晕（见图1）。

图1 榆叶梅叶斑病症状Figure 1 Lagerstroem ia indica and Am ygdalus trilobalm p lum disease sym ptom s

2.2 单斑分离率

从榆叶梅感病叶片单斑中，共分离出2个菌株，命名为M1和M2，其单斑分离率为18.3%和28.33%。依据单斑分离率的大小，初步推断导致榆叶梅叶斑病的病原菌可能是M2。而接种健康叶片的对照组均无菌落生长。

2.3 病原菌鉴定

2.3.1 形态学鉴定

榆叶梅致病菌M2：28℃、PDA培养基培养7 d后，菌落表面湿润不光滑，呈青灰色，有轮纹，菌落背面呈轮纹生长中心为黑色。分生孢子梗榄褐色，有隔膜0～7个，上部屈曲，有显著孢子痕，14～48μm×6～13μm；分生孢子单生或形成4个孢子短链，长卵形或倒棍棒形，有横隔膜3～18个，纵膈膜0～15，灰榄褐色有长喙（见图2）。初步鉴定为半知菌亚门（Deuteromycotina）、丛梗孢目（Moniliales）、暗梗孢科（Dematiaceae）、交链孢霉属（Alternaria）的甘蓝长尾交链孢霉（Alternaria brassicae）。

2.3.2 分子生物学鉴定

以榆叶梅致病菌M2的DNA为模板进行PCR扩增，得到一个长度为536 bp的扩增片段。PCR产物测序，所得的rDNA-ITS序列在NCBI网站上与已知序列进行BLAST比对，菌株M2与已登录注册的甘蓝长尾交链孢霉（Alternaria brassicae）比对所得分值最大，相似率最高且为99%。构建的系统进化树中，聚类结果见图3。依据分子生物学鉴定结果，大连榆叶梅叶斑病病原真菌是交链孢霉属（Alternaria）的甘蓝长尾交链孢霉（Alternaria brassicae）。

2.4 分离菌株的致病性

将榆叶梅感病叶片单斑分离出来的2株真菌，分别进行单菌株和混合菌株接种。试验结果表明，菌株M1不能导致接种叶片发病，而M2接种48 h后叶片开始发病，发病率为100%；用M1和M2混合接种，48 h后叶片开始发病，发病率为100%。接种叶片表现出的症状与田间自然发病症状相似，而对照未发病。从接种发病的病组织再次分离出真菌，菌落形态、孢子形态与接种菌株一致。由此证明了榆叶梅叶斑病是由M2侵染所致。

图2 榆叶梅致病菌M 2菌落及分生孢子Figure 2 Colony morphologies and conidial shape of the pathogen M 2

图3 菌株M 2的rDNA-ITS系统进化树Figrue 3 Neighbor-joining tree constructed from M 2 ITS sequences

3 讨论

园林植物在绿化美化城市的同时，作为活体材料在生长发育过程中，极易受到各种病原微生物的侵染，引发各种病害，其中叶斑病是影响植株美观和品质较为严重的病害［6］。有关榆叶梅常见的病害有枝枯病和叶斑病［4、8、9］，但关于其叶斑病的病原菌鉴定研究鲜有报道。本研究对大连市园林中的榆叶梅叶斑病，进行了致病菌的形态学及分子生物学鉴定，查明了大连市榆叶梅叶斑病致病菌是甘蓝长尾交链孢霉（Alternaria brassicae），这为园林部门针对性地防病提供了重要依据。链格孢菌寄主较多［10］，可导致多种植物发生病害，但其侵染榆叶梅鲜有报道。

［1］ 许善忠.榆叶梅常见病虫害的发生与防治［J］.吉林农业，2015（9）：101.

［2］ 兰茂.滇南本草［M］.昆明：云南人民出版社，1959.

［3］ 张庆忠.园林植物常见病虫害及其防治措施［J］.现代园艺，2014（2）：67～69.

［4］ 姜华，修玉萍，郑音，等.碱蓬内生枯草芽孢杆菌分离鉴定及抑菌活性检测［J］.辽宁师范大学学报（自然科学版），2011，34（4）：503～507.

［5］ 方中达.植病研究方法［M］.北京：中国农业出版社，1998.

［6］ 魏景超.真菌鉴定手册［M］.上海：上海科学技术出版社，1979.

［7］ 李永，岳志强，朴春根，等.链格孢属真菌的分子复合鉴定及系统发育树研究［J］.中国农学通报.2013，29（27）：165～169.

［8］ 康永，陈红，刘继成，等.榆叶梅常见病害防治浅谈［J］.现代园艺，2011（16）：43.

［9］ 王娜，罗乐，张启翔，等.榆叶梅品种资源调查及已知品种数据库管理信息系统构建［J］.南方农业学报，2013（5）：865～870.

［10］ 姜华，鲍竹，王晶.药用观赏植物—鸟巢蕨叶斑病病原菌鉴定初报［J］.辽宁师范大学学报，2016，39（1）：93～97.

Identification of Pathogens on Amygdalus triloba Leaf Spot of Dalian City

XIE Ying1，WANG Jing2，JIANG Hua1（1．College of Life Science，Liaoning Normal University，Dalian，Liaoning 116029； 2．Dalian Forest Zoo，Dalian，Liaoning 116013）

Amygdalus triloba which is also called small peach，are green landscaping urban garden common species，which has a high ornamental value of the garden.and medical value.But in recent years，Dalian garden of the elm leaves plum leaf disease occurred heavier，therefore，to identify the cause，the rightmedicine，it is imminent.In this paper，we collected the susceptible leaves，identified by pathogenicity，pathogenicity identification and molecular biology identification.The pathogen identification of leaf spot in the Elm pratensis was carried out.The results showed that the pathogens of the Amygdalus triloba were Alternaria brassicae.

Amygdalus triloba；Leaf spot；Identification of Pathogens

S436.8

B

1002-1728（2017）06-0073-03

10.3969／j.issn.1002-1728.2017.06.017

2017-10-14

辽宁省教育厅大学生创新训练项目（201510165037）

谢颖（1991-），女，研究生，研究方向为植物病理学。E-mail：1398572709＠qq.com通讯作者：姜华（1958-），女，博士，教授，主要从事植物病理学研究。E-mail：jianghua1225＠163.com