氘代同位素内标液相色谱-质谱联用测定黄酒中的氨基甲酸乙酯

贾素中,欧 杰,王 婧,许 禄

上海海洋大学 食品学院;上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心,上海 201306

氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate,EC)是发酵食品和酒精饮料中的一种自发生成的伴随产物。研究表明，氨基甲酸乙酯是一种多位点致癌物，可导致淋巴癌、肺癌、肝癌和皮肤癌等疾病[1-4]，并且与乙醇混合会促进其致癌性[3,4]。鉴于其具有致癌性，目前国际社会认为EC是食品中继黄曲霉毒素之后的又一重大问题[2]。1974年，世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）将其列为2B类致癌物。2007年3月，将EC从可能致癌物质2B类提高为2A类[5]。在20世纪70、80年代，世界各国学者先后又在蒸馏酒（例如朗姆酒、威士忌、白酒等），发酵食品（腐乳、泡菜、酱油等），发酵酒精饮料（黄酒、啤酒、清酒）这些食品中检测到了氨基甲酸乙酯[2]。1985年，加拿大的卫生与防疫部门对酒精饮料中氨基甲酸乙酯含量制定了强制性限量标准。之后美国、英国、瑞士、韩国、日本等国家先后开展了有关氨基甲酸乙酯的毒理学、暴露水平和危险性评估的研究工作[6,7]。2002年联合国粮农组织(FAO)开始重点监控发酵食品中的氨基甲酸乙酯，并制定了国际标准，规定其含量不能超过20 μg/L[7,8]。中国虽然目前暂时还没有对氨基甲酸乙酯做任何明确的限定标准，但是人们对氨基甲酸乙酯的关注却日益增多[9]。为了更好的监控我国黄酒中EC含量，适时开发出一种操作比较简单、速度较快、高效的检测方法就显得非常重要了。

目前国内外关于EC的检测方法众多，主要有二氯甲烷/气相色谱-质谱法（GC/MS）、固相微萃取/气相色谱-质谱法（GC/MS）[10-12]，气相色谱-质谱-质谱法(GC-MS/MS)[13-15]，二维或多维色谱稳定同位素稀释质谱联用技术，气相色谱/热离子检测器（GC/TSD）法，高效液相色谱结合荧光检测器(HPLC-FLD)法[16-18]，液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)、薄层色谱法[19]，也有免疫相关方法的研究[20]，但是未见在免疫相关方面的成熟应用。

本文建立了高效液相色谱-串联质谱测定黄酒中氨基甲酸乙酯的分析方法。该方法利用了液相色谱高效的分离能力和四级杆质谱的高灵敏度的定量检测能力，样品前处理比较简单，采取直接进样的方式，简单、快速、准确。并对方法的检出限、线性、样品加标回收率及精密度等方法评价标准进行了研究，得到了较为满意的结果。

1 实验材料和方法

1.1 仪器与试剂

仪器：采用2695 Quattro Micro型液相色谱串联质谱联用仪(美国Waters公司)；AR1140电子天平（精确到0.0001 g）(梅特勒-托利多仪器有限公司)；SK3-SB2200超声波清洗器(必能信超声（上海）有限公司)；0.22µm有机滤膜(上海安普科学仪器有限公司)；Milli-Q Reference超纯水发生器(美国Waters公司)。

试剂：氨基甲酸乙酯(EC CAS:51-79-6纯度99.9%(德国Dr.Ehrenstorfer公司)-18℃保存)；D5-氨基甲酸乙酯(D5-EC内标CAS:73962-07-9纯度99.8%(美国Sigma-Aldrich公司)-18℃保存)；甲醇、乙腈、甲酸、乙酸、乙酸铵(HPLC级)；超纯水:由Milli-Q超纯水机提供。

不同种类的黄酒样品均在上海某超市购买。

1.2 标准储备液的制备

用电子天平分别准确称取EC和D5-EC各10.0 mg(精确到0.1 mg)于10 mL的棕色瓶内，用甲醇水溶液（v:v=25:75）定容至刻度线，分别配制成1000 mg/L的标准储备液，（-20℃保存，有效期为1个月）。再根据需要逐级稀释到实验所需要的浓度。

1.3 检测条件

1.3.1 LC的检测条件 Waters SunFireTMC18色谱柱（2.1×50 mm column，3.5 μm）为分析柱，流动相为甲醇(A)和0.1%的乙酸水溶液(B)，洗脱程序：25%A和75%B等梯度洗脱，流速为0.30 mL/min，柱温为40℃，自动进样量为10 μL。

1.3.2 MS的检测条件 电喷雾离子源正离子模式（ESI+），检测方式为多反应监测模式（MRM模式），毛细管电压为3.00 kV；离子源温度120℃；脱溶剂气流速为600 L/h，脱溶剂温度350℃，锥孔气流速50 L/h，碰撞气体为惰性气体氩气(Ar)，扫描方式为正离子扫描，驻留时间50 ms。

1.4 样品的前处理

准确量取1.00 mL黄酒置于10 mL容量瓶内，用甲醇-水溶液（v:v=25:75）定容至刻度线，然后加入一定量的内标D5-EC，振荡器混匀。然后通过0.22 μm的有机滤膜，上机备用。

1.5 定性定量

采用自动进样，进样量为10 μL，分别选择m/z61.9和m/z62.9作为EC和D5-EC的定量离子，测定EC(m/z90.0/61.9)和D5-EC(m/z95.1/62.9)的峰面积，以二者的峰面积比值比与标准系列溶液中EC的浓度(μg/L)绘制标准曲线，根据测定的样品溶液中EC和D5-EC的峰面积比从标准曲线上得到样品溶液中EC的浓度，从而可计算出样品中EC含量(μg/L)[19]。以保留时间和EC标准溶液测定的m/z 61.9作为定性依据。在实际样品测定EC时保留时间范围小于±0.5 min。

2 结果与分析

2.1 样品前处理条件的优化

样品中的EC若采取传统的固相微萃取或者用有机溶剂液液萃取，不仅回收率低而且重现性较差。该方法采用直接进样的方式进行分析，为了减少基质效应对被测组分EC的干扰，本实验采用对样品进行适当的稀释。通过考察对样品进行1～15倍的稀释，发现随着稀释倍数的逐渐增大，基线较稳，峰形较好，基质效应对样品测定的影响逐渐变小（2～4倍响应值最好），当继续稀释时，被测组分浓度较低，基线不稳，峰形开始变差，响应值较低。因此本文采用对黄酒样品进行2～4倍稀释。

2.2 实验条件的优化

2.2.1 LC条件 为了得到较好的色谱图和改善分离效果，对反相柱常用的有机流动相（如乙腈、甲醇），常用的水相（如甲酸、乙酸、甲酸铵、乙酸铵溶液）进行了分离和质谱考察，分析色谱峰和离子化程度。结果表明甲醇-水的洗脱效果比较好，在甲醇-水流动相体系中加入乙酸后发现不但可以获得较高的分离度和灵敏度，进一步分析0.1%和0.2%乙酸，发现加入0.1%的乙酸响应值较高，所以本实验的流动相体系选择甲醇-水溶液（0.1%乙酸）。标准品EC和D5-EC的MRM模式下的色谱图如下图1。

图1 EC（20 μg/L）和D5-EC（20 μg/L）标准溶液的MRM色谱图Fig.1 MRM chromatograms of EC(20 μg/L)and D5-EC（20 μg/L）

2.2.2 MS条件 采用MRM模式采集EC和D5-EC的母离子及对应的响应比较好的子离子，EC和D5-EC的相对分子质量都比较小，电离后只能选出一个特征离子作为定性和定量离子，EC和D5-EC的保留时间、母离子、子离子、以及锥孔电压和碰撞能量等参数见表1。

表1 EC和D5-EC的质谱条件Table 1 MS-MS parameters for EC and D5-EC

将被测组分进行全扫描检测，得到一级质谱图，EC为m/z90.0，D5-EC为m/z95.1（如图2和3），然后用惰性气体Ar轰击母离子，获得其二级质谱图及其碎片离子。EC和D5-EC的二级特征离子分别为m/z61.9和m/z44，与m/z 62.9和m/z44，m/z44的碎片离子是由母离子脱去乙氧基形成的，其离子丰度较小，而m/z61.9和m/z62.9是由母离子脱羰基形成的，离子丰度很大。我们一般定量一个化合物时通常用2个子离子都能被观察到，本实验所测的EC浓度很低时，m/z90.0/44信号很弱，但是m/z90.0/61.9的信号非常的强，特征非常明显，因此可以对EC进行检测和定量分析。D5-EC在理化特性和色谱分离行为中具有与EC非常相似的表现，能够更好地校正分析过程中各种因素对EC测定结果的影响，提高EC分析的回收率，使检测结果更准确、稳定。目标化合物相对分子比较小，结构简单，经过质谱碰撞分裂后只能得到一个比较明显的特征碎片离子。我们根据母离子(m/z90.0和m/z95.1)及非常明显的特征碎片离子(m/z61.9和m/z62.9)组成定性和定量离子对，同时根据保留时间以及离子丰度对目标化合物EC进行定性定量分析。

图2 EC的一级质谱扫描图Fig.2 Full scan mass spectrum of EC

图3 D5-EC的一级质谱扫描图Fig.3 Full scan mass spectrum of D5-EC

2.3 线性范围与检出限以及定量限

分别配制一系列不同浓度的EC标准溶液浓度为2，5，10，20，40，80，200，500 μg/L，D5-EC标准液20 μg/L按上述色谱-质谱操作条件进行测定，记录标准溶液EC和D5-EC的响应值，然后以EC和D5-EC的浓度比为横坐标，以EC和D5-EC的峰面积比为纵坐标进行线性回归方程，获得EC的标准曲线及相关系数，标准曲线线性关系和检测限为:回归方程Y=1.06х+0.147，R2=0.9922（х为EC和D5-EC的浓度比，Y为EC和D5-EC响应比）以样品分析中靠近EC色谱峰的基线噪音值，按信噪比S/N为3确定其检测限（LOD）为1.8 μg/L，以S/N为10确定定量限(LOQ)为5.0 μg/L。

2.4 回收率和精密度

从市场上购买的三种酒样各取250 mL经过0.22 μm的有机滤膜过滤,经过适当稀释倍数后取1 mL备用，再分别添加10 μg/L、20 μg/L和100 μg/L氨基甲酸乙酯标准溶液，充分混合上机测定，每个添加水平测定6次，分别测定不同品牌的黄酒高低浓度的加标回收率为88.9%～103.1%；考察方法精密度，EC含量的相对标准偏差均小于10%，符合方法性能指标的要求，测定结果见表2。

表2 黄酒中氨基甲酸乙酯回收率和相对标准偏差（RSD）(n=6)Table 2 Recoveries and relative standard deviations(RSDs)of EC spiked in Chinese rice wine(n=6)

2.5 实际样品的测定

根据以上建立的方法，分别对市场上购买的10种黄酒样品，每种样品平行测定3次，测定结果见表3。通过检测发现市场上购买的黄酒均检出了一定含量的EC，当年酿造黄酒中EC含量较低，陈酿黄酒中EC含量普遍偏高，并且陈酿时间越长，其中的EC浓度越高。

表3 实际样品中EC含量 (n=3)Table 3 Contents of EC in real samples(n=3)μg/L

3 结论

建立了以D5-氨基甲酸乙酯作内标物，利用液相色谱串联质谱法直接快速测定黄酒中氨基甲酸乙酯（EC）含量的方法。该方法能以高效的分析效率快速完成整个分析过程（10 min内），与以往的方法比较大大缩短了分析检测时间。且样品经过简单稀释后直接进样，不需要浓缩、萃取以及净化等复杂的前处理过程。该方法准确、可靠、灵敏度高，方法重现性较好，能够满足酒类产品中氨基甲酸乙酯的常规快速检测。

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