53种不同来源灵芝子实体多糖含量差异研究

陈凌华，程祖锌，许 明

(福建农林大学)

0 引言

实验中通过菌草栽培收集到的不同灵芝属子实体样品共53份，范围涉及松杉灵芝 (Ganodermatsugae)、密纹灵芝(Ganodermatenus)、树舌灵芝(Ganodermaapplanatum)、紫芝(Ganodermasinense)与赤芝(Ganodermalucidum)等品种.采用热水浸提法提取灵芝子实体多糖，苯酚硫酸法测定多糖含量.通过对53份来源不同的灵芝属的子实体多糖的定量分析，发现各品种的多糖表达量之间具有明显差异，该研究可为灵芝多糖等活性物质的研发与应用提供参考价值.

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 供试菌株

供试灵芝菌种53份(见表1)，由福建农林大学菌物研究中心保藏，菌株主要分为以下几类： 赤芝(38个，编号1-38)，树舌灵芝(1个，编号39)，紫芝(3个，编号40-42)，密纹灵芝(2个，编号43-44)与松杉灵芝 (9个，编号45-53).对照品2个，分别是同期栽培的菌草灵芝与段木灵芝.

表1 灵芝菌种

续表1 灵艺菌种

1.1.2 培养基

PDA培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、水1000mL.

菌草培养料：水∶石膏∶麦皮∶芒萁∶五节芒=55∶1∶10∶15∶24.

1.1.3 试剂

高职院校生物化学教学改革的探讨永远在路上。作为授课教师，应在教学实践中不断探索新的教学思路和方法，使学生在有限的学习时间内，既掌握专业基础理论知识，又具备从事本专业实际工作的基本技能和初步能力。

无水葡萄糖(基准纯)、以及乙醇、浓硫酸、苯酚等生化试剂(分析纯).

1.2 方法

1.2.1 热水法提取灵芝子实体多糖

子实体多糖提取采用实验室优化的热水法[8]，步骤具体如下：称取子实体粉末(过10目筛)5 g，95%乙醇100 ℃浸提3次，每次30 min(去除脂溶性物质).抽滤，取料渣按1∶30的料水比在100 ℃热水条件下浸提3 h，浸提液减压浓缩后，乙醇4 ℃沉淀过夜，冻干得粗多糖样品.

1.2.2 灵芝多糖含量测定：苯酚-硫酸法

(1)绘制葡萄糖标准曲线

分别用吸量管移取体积为0.00、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40 mL浓度为1.25 mg/mL的葡萄糖标准溶液于试管中，加蒸馏水至2.00 mL，依次加入1.00mL的5%苯酚溶液混匀，快速加入5.00mL的浓硫酸，立即振荡混匀并于冰浴放置20 min.以2.00mL蒸馏水为试剂空白，室温下选择490 nm波长测定上述溶液的吸光度，绘制葡萄糖标准曲线.

(2)53种不同来源灵芝子实体多糖的含量测定

称取冻干保存的粗多糖10.00 mg，定容于50.00 mL容量瓶，取粗多糖样品溶液按上述相同操作并测定吸光度，根据标准曲线换算得到样品液中的葡萄糖浓度ρ(mg/mL).

公式中ρ为样品液的葡萄糖浓度(mg/mL)，V为配制的多糖样品液体积(mL)，m为粗多糖的取样质量(mg).

2 结果与分析

2.1 灵芝多糖含量测定

2.1.1 多糖标准曲线绘制

苯酚-硫酸法绘制的标准葡萄糖曲线为：A=49.887×ρ+0.011，回归系数γ=0.9994 (A表示吸光度，ρ表示葡萄糖浓度).

2.1.2 多糖含量测定

53份灵芝子实体多糖含量的测定结果见表2.

子实体多糖含量(%)=粗多糖提取率×粗多糖中多糖含量

53份来源不同的灵芝属子实体多糖定量测定结果显示，不同灵芝属子实体的多糖含量之间有明显差异(见表3)：(1)在粗多糖平均提取率方面，紫芝最高(6.33%)，树舌灵芝次之，赤芝的平均粗多糖提取率仅为紫芝的32.54%；3个紫芝品种中42号的粗多糖提取率最高(7.60%)，为对照品菌草灵芝的2.04倍.(2)粗多糖中多糖平均含量方面，赤芝最高(35.74%)，其次是密纹灵芝与松杉灵芝，紫芝较低；紫芝粗多糖中的多糖平均含量仅为赤芝的76.11%；38个赤芝品种中粗多糖的多糖含量最高的为27号(43.52%)，为对照品菌草灵芝的1.29倍.(3)子实体多糖平均含量方面：子实体多糖含量高低是由粗多糖的提取率、粗多糖中多糖含量这两个方面共同决定的.子实体的多糖平均含量最高的是紫芝(1.72%)，其次为树舌灵芝，赤芝的子实体多糖的平均含量较低，仅为紫芝品种的(42.44%)；3个紫芝品种中子实体多糖含量最高的为42号(2.05%)，为对照品菌草灵芝的1.64倍.

表2 53份灵芝子实体的的粗多糖提取率与多糖含量

续表2 53份灵芝子实体的的粗多糖提取率与多糖含量

注： 粗多糖提取率(%)=粗多糖质量/子实体质量 子实体多糖含量(%)=粗多糖提取率×粗多糖中多糖含量

表3 不同亚属灵芝的的平均粗多糖提取率与平均多糖含量

该实验除了以同期生产的菌草灵芝作为对照品外，还测定了段木灵芝的粗多糖含量，结果表明：尽管菌草灵芝的粗多糖中纯多糖的含量不及段木灵芝，但由于菌草灵芝具有较高的粗多糖提取率，因此菌草灵芝子实体的多糖含量(1.99%)在1%的显著水平下仍然明显高于段木栽培灵芝(1.92%)，这也从量上反映出灵芝的菌草栽培可有效代替段木栽培.

3 讨论

灵芝在我国具有悠久的药用历史，其活性成分多糖含量的高低已成为衡量灵芝品质的重要指标.由于灵芝品种繁多，种间与品种间的不同均有可能引起有效成分多糖在含量表达上的差异[9].即使是相同的菌株，在生长过程中因外界环境、营养与栽培形式的不同，仍可引起多糖含量表达的不同.该研究对收集到的53份灵芝属材料，在严格控制客观的栽培环境下，重点研究遗传背景的差异对灵芝多糖含量的影响.该实验采用绿色环保的菌草栽培技术，从母种，原种、栽培袋的制备过程中，严格控制接菌量、培养基量的一致，并在相同的大棚栽培环境下(相对湿度90%，温度22～28℃，通风，散射光照射)进行生长，并做到同期接菌、同期采收.

排除了客观的栽培条件或营养条件差异可能对子实体多糖含量的影响，多糖含量差异主要就由其遗传背景或种性决定.本实验的多糖含量测定结果表明，灵芝不同亚属间的多糖含量存在显著性差异：紫芝子实体多糖的平均含量最高(1.72%)，其次为树舌灵芝(1.53%)，然后依次是密纹灵芝(0.94%)、赤芝(0.73%)与松杉灵芝(0.63%)；其中赤芝的子实体多糖的平均含量(0.73%)仅为紫芝品种的42.44%.此外，即使是同一亚属的灵芝菌株，由于其遗传背景或来源不同，多糖含量也存在明显差异，例如本实验中的38个赤芝菌株，其子实体的多糖含量分布较为广泛，多糖含量最高的品种(36号南韩灵芝1.55%)是最低的品种(16号京大0.51%)的3倍以上.

目前市场供求的灵芝品种比较丰富，但缺乏有效的国家标准对其质量高低进行甄别，而种质资源的优劣是影响食用菌产量及质量的关键因素.本实验结果对于高多糖灵芝种质的选育以及灵芝活性多糖的研发具有一定的参考依据.多糖含量测定结果表明，由于遗传种性的不同，不同亚属、以及同一亚属下的不同菌株的灵芝子实体多糖含量之间存在明显差异.目前市面上应用最为广泛的主栽品种为赤芝，其次为紫芝.赤芝和紫芝都是《中国药典》[10]正式收录的药用真菌.有研究表明紫芝、松杉灵芝、密纹灵芝等品种具有不同于赤芝的独特生物学活性[11]，该研究通过比较不同遗传背景的灵芝子实体在相同栽培环境下的多糖含量差异，旨在为以灵芝多糖为代表的活性物质的研发以及不同灵芝属多糖的药理活性研究提供参考价值.