免疫层析试纸条上转换发光检测系统的研究与开发*

刘 超,王晓荣,许新岳,王换换,王 翔

(南京工业大学电气工程与控制科学学院,南京 211816)

免疫层析试纸条上转换发光检测系统的研究与开发*

刘 超,王晓荣*,许新岳,王换换,王 翔

(南京工业大学电气工程与控制科学学院,南京 211816)

针对目前市场上上转换发光检测系统体积较大、不具便携性、线性范围窄等缺点,基于上转换发光免疫分析原理,充分运用电子学、光电学、机械学等多个学科,对免疫层析试纸条上转换发光检测系统进行研究与开发。主要内容包含光学系统设计、平台驱动系统设计、嵌入式系统设计、计算机系统设计。通过测试,检测系统具有良好的稳定性与测量精度,测量相对误差小于1.5%,表明符合设计要求,具有一定的应用价值。

免疫层析试纸条;上转换发光;光电检测;嵌入式系统

上转发光技术,是以上转发光材料UCP(Up-Converting Phosphor)[1]颗粒作为示踪物的一种新型的检测技术。将UCP颗粒进行表面的修饰和活化后,便可以结合种类繁多的生物活性分子,用来作为医学检测的标记物。目前我国医学方面即时检验POCT(Point Of Care Testing)领域几乎被国外进口厂家所垄断,而且市场上的上转换发光检测系统大都有体积较大、不具便携性、线性范围窄等缺点。

通过上转发光结合免疫层析技术应运而生的上转发光免疫分析平台,是我国自主研制的即时检验免疫分析技术[2]。该系统性价比高,性能优异,适用性强的优势,必将产生巨大的经济效益,进一步推动企业和行业发展。本文结合以上背景,运用多个学科综合知识,对免疫层析试纸条上转换发光检测系统进行研究与开发。

1 免疫层析试纸条上转换发光检测原理

1.1 上转换发光原理

一般地,用能量较高的光去激发材料,才能得到能量较低的光,但是有些材料受激发时,激发光能量要高于光源,这种现象称为反斯托克斯发光,又称为上转换发光[3]。其原理和过程有激发态吸收(ESA)、能量传递上转换(ETU)和光子雪崩(PA)3种:激发态吸收是上转换发光的基本过程,是同一个离子从基态通过连续多光子吸收到达能量较高的激发态的过程;能量传递是指通过非辐射过程将两个能量相近的激发态离子藕合,其中一个把能量转移给另一个回到低能态,另一个离子接受能量而跃迁到更高的能态;光子雪崩是能量相同的粒子会泵吸能量不同的粒子,使得粒子间能量转换效率大于一。由于发生了交叉弛豫作用,粒子处于平衡状态的时间会变短,从而产生的光强增大,这时便会出现上转换现象[4]。根据上转换发光的机理,普通发光、单离子吸收双光子发光和上转换发光的原理图如图1所示。

图1 3种发光情况出现的原理图

1.2 免疫层析试纸条检测原理

免疫层析试纸条基于免疫标志物显色或者发光的原理,通过检测带和质控带来定性或定量地检测待测物。使用时,将样品滴到样品垫上,由于吸水垫可以产生虹吸作用,所以样品会流经结合垫,结合垫中具有UCP及抗体结合物,样品中如果具有待测物质便会与其发生反应。在层析过程中免疫复合物被富集在层析材料的T线区域,而游离的标记物则越过T线与C线上的受体发生高特异性免疫反应,达到与标记的结合物自动分离和富集,因此根据颜色的有无或发光强度可以定性或者定量地判定待测物质的存在或浓度。图2是免疫层析试纸条结构图。

图2 免疫层析试纸条结构

本研究设计的检测系统运用了多个学科的知识,首先运动平台带动试纸条运动,使得光电检测系统可以对试纸条上的每一个点进行扫描,从而检测到T带和C带上的UCP颗粒物含量,经过运算便可以计算出待测液体中需要确定的生物分子含量。在检测时,试纸条表面会被红外光照射,由于每种UCP需要的激发光波长和频率不一样,所以要根据实际情况选择所需的光源。试纸条受到激发后,会发出可见光。此时便需要通过成像系统滤除杂散光,将一定波长的上转换光聚集到光电检测元件上,光电检测原件检测光信号并将其转换为电压信号,方便后续处理。最后由嵌入式系统采集并处理采集来的电信号,并依据一定算法计算出结果[5]

2 系统架构及实现方案

2.1 整体架构

上转换发光检测系统主要由4部分组成,包括光学系统、平台驱动系统、嵌入式系统、计算机系统,整个系统的框图如图3所示。

图3 系统整体架构

光学系统中,免疫层析试纸条表面受到半导体激光器的激发,发出UCP上转换光。通过成像系统将UCP上转换光分布成像在光电倍增管光敏面上。光电倍增管将接收到的上转换光信号转换为电压信号。

平台驱动系统中,步进电机带动工作平台一起运动,从而带动平台上的试纸条运动,使得光学系统采集到试纸条上每一个点的上转换光信号。

嵌入式系统中,电压信号通过滤波电路、AD采样传输给主芯片,在经过一系列算法后,计算出待测液体的浓度值,并实时显示,方便用户观察。

计算机系统中,将嵌入式系统通过串口传输过来的数据进行显示、存储。

将前3个分系统置于密闭箱中,并通过USB连接到计算机系统,实物架构如图4所示。

图4 实物架构图

2.2 光学系统和平台驱动系统

光学系统由照明系统、成像系统、光电探测器3个部分构成,其结构如图5所示。980 nm半导体激光器发出的光由柱面镜形成光斑,通过分色镜的反射,照射在免疫层析试纸条上。激发出来的上转换发光通过聚焦镜的准直,再透过分色镜和滤光镜,滤去杂散光,最后经由聚焦镜聚焦于光电倍增管光敏面上[6]。

图5 光学系统结构

针对层析试纸条进行一维扫描测量,设计了平台驱动系统,带动试纸条进行一维运动。平台驱动系统主要由一维运动平台、步进电机、步进驱动器、步进电机控制器4个部分组成。试纸条放置在由步进电机驱动的一维运动平台上,来进行试纸条的一维扫描测量。一维运动平台由传动螺母、丝杆、联轴器、传感器组成。步进电机带动丝杆使平台在一维轨道上不断运动。运动的长度和步进电机转动的角度有关,而运动方向由电机转动方向决定。传感器实时捕捉平台运动的状态,并将信号传输给步进电机控制器,使电机的运动状态发生改变。

3 嵌入式系统

3.1 硬件设计

嵌入式系统是检测系统中最为关键的部分,为了使免疫层析试纸条上转换发光检测系统达到高可靠性、高精度、高稳定性,必须对其硬件进行合理设计。嵌入式系统主要实现对光学系统输出的电压信号进行采集、处理、存储、传输,以及步进电机的控制。依据上述功能要求嵌入式系统的主要构成为AD采样模块—采集数据、CPU—处理及控制、光耦—控制平台、液晶屏—显示浓度值以及浓度曲线、外部Flash—存储数据、USB数据传输—传输数据、电源—供电。将这些器件置于一块PCB板上,其硬件架构如图6所示。

图6 嵌入式系统硬件架构图

系统中采集的模拟信号为光学系统传输过来电压信号,虽然光电探测器SiPM模块输出范围为0～5 V,但是由于上转换光信号较为微弱,该模块的输出范围为0～1 V。所以选用AD7705芯片来进行A/D转换。

AD7705是一款Σ-Δ16位用来进行A/D转换的芯片,自带校正功能[7],其内部结构如图7所示。它由前端模拟调节电路包含增益可编程放大器(PGA)与缓冲器、可编程数字滤波器以及Σ-Δ调制器等组成。当AD7705接收到传感器信号后,会根据自身的量程将信号范围放大。

图7 AD7705内部结构

AD7705 芯片的接口属于串行通信,与主芯片连接时使用三线制。外围电路如图8所示,AIN1(+)、AIN1(-)和AIN2(+)、AIN2(-)为两组模拟信号输入端,可以配置成差分输入和单极性输入;CS为片选信号端,低电平有效;DOUT用来输出结果,DIN 用来输入待转换的传感器信号;SCLK为芯片提供时序脉冲,一般和CPU相连,来给出高低电平,低电平表示AD 转换结束可以读取数据,高电平表示数据正在更新中;REF(+)、REF(-)为基准信号输入端。当外接基准电压2.5 V时,精度较高,因此选用了LM285D芯片进行供电,它可以稳定地输出2.5 V电压。

图8 AD7705相关电路

3.2 算法设计

免疫层析试纸条上转换发光检测系统最终显示结果为待测液体的图谱与浓度值,结果都是通过嵌入式软件处理计算得出的。

在实际的检测过程中,由于受到噪声干扰,波形图并不会和理想的一样。不仅曲线比较毛糙,还会出现基线发生漂移且受到干扰等情况。因此需要先进行滤波去噪以及基线拟合来去除干扰,再检峰并计算峰面积值。上转换发光免疫试条检测的算法流程图如图9所示。

本系统采用滑动平均的方法对原始数据进行滤波,每次采用前5个光强值做平均替换后一个光强值。这种方法既可以使曲线变得平滑,又可以防止有效信号被滤除。由于温度和背景光等干扰,光强曲线的基线会出现漂移,使用最小二乘法对原始数据拟合出本底数,并将原始数据减去本底数。最终浓度值的计算,将在做好前期处理的检测带与控制带峰值附近取M点求平均值,将得到的C、T平均值做比值,再将计算出的T/C值代入标准浓度与T/C值拟合的线性方程中,最后反推出样品浓度。

图9 算法流程图

3.3 软件设计

软件程序根据系统中各个功能模块进行划分,主要可以归纳为:A/D采样模块、算法设计模块、外部存储模块、液晶屏模块及USB通讯模块等。软件系统的总体架构如图10所示。

首先,激光激发的上转换光信号被PMT接收后转换为电压信号,再经过AD采样后转化为光强数值信号,并发送给STM32F103RB。它接收到这些信号后,存入外部FLASH,使得后续程序可以调用这些数据,并对这些数据进行处理。AD模块将模拟信号转换为电压信号后,CPU需要先通过滑动平均算法对数据进行滤波,再通过最小二乘法拟合直线,最后进行比值计算等,从而计算出待测物浓度。最终,将检测的浓度结果值和原始的光强曲线传输到计算机系统进行进一步研究。

图10 嵌入式软件架构图

4 计算机系统设计

借助LabVIEW开发平台,将各个功能的程序封装为一个图标,调用程序图块,来实现功能。利用LabVIEW图形显示的基本方法——波形图和电子表格函数,更加方便、直观的显示存储的数据[8]。图11为使用LABVIEW调用储存于计算机系统中的浓度为750 ng/mL的光强曲线图,图中数据已通过算法处理。

图11 750 ng/mL数据处理后的光强曲线

5 测试分析和总结

5.1 稳定性测试

为了检测系统的稳定性,实验时采用浓度为200 ng/mL的同一根试纸条测量10次。然后通过公式:

(1)

计算出变异系数,式中xmax表示样品浓度测量最大值,xmin表示样品浓度测量最小值,表示标准气的浓度。

将数据转化为稳定性曲线,如图12所示,T/C线较为平缓,可以表明此系统比较稳定。

图12 同一试纸条多次测量曲线

5.2 重复性测试

测试时,选取8种不同浓度的标准液体,然后对每种标准液体进行十次测量,实验数据如表1所示。衡量重复性的计算公式为:

u=(SD/Mean)×100%

(2)

式中:SD表示测得数据的标准差,Mean表示测得数据的平均值,可以计算出系统以8种不同浓度待测液体测量时的不确定度,从计算结果可以得知不确定度皆小于1.5%,从而表明系统有很好的重复性。

5.3 总结

该系统基于上转换发光免疫分析原理,通过激光激发上转换光设计光学系统,利用一维运动平台带动试纸条运动设计平台驱动系统,通过光强检测确定样品浓度设计嵌入式系统,利用计算机实现历史数据调用与显示设计了计算机系统。4个分系统相互配合,从实验结果可以表明,该系统具有良好的实用性与可行性,满足检测需求。

表1 不同浓度试纸条重复测量得到的T/C值

[1] Gnach A,Bednarkiewicz A. Lanthanide-Doped Up-Converting Nanoparticles:Merits and Challenges[J]. Nano Today,2012,7(6):532-563.

[2] 张文珠,王桂兰,叶志强,等. 生化分析用荧光纳米粒子研究进展[J]. 分析科学学报,2010,26(6):724-731.

[3] 高锦,徐爱芳. 上转发光免疫层析技术在临床疾病病原体检测中的应用[J]. 中国卫生检验杂志,2013,23(17):3468-3470.

[4] 安海萍. 稀土掺杂ZnS量子点的制备与发光性能研究[D]. 天津:天津理工大学,2007.

[5] Hua F. Development and Evaluation of an Up-Converting Phosphor Technology-Based Lateral Flow Assay for Rapid Detection of Francisella Tularensis[J]. Scientific Reports,2015,26(5):17177-17178.

[6] 韩勇. 光电检测电路的噪声分析与处理[D]. 哈尔滨:哈尔滨工程大学,2011.

[7] 赖义汉,傅智河. 基于AD7705及FPGA的光信号采集系统设计[J]. 河南科技学院学报(自然科学版),2015(1):55-60.

[8] 徐尧. 基于现场总线通讯控制的可二次开发虚拟仪器系统的设计[D]. 上海:华东理工大学,2013.

ResearchandDevelopmentofImmunoassayTestStripUp-ConversionLuminescenceDetectionSystem

LIUChao,WANGXiaorong*,XUXinyue,WANGHuanhuan,WANGXiang

(College of Electrical Engineering and Control Science,Nanjing TECH University,Nanjing 211816,China)

Regarding to the shortcomings of larger volume,less portability,narrow linear range and others of the present market,up-conversion luminescence detection system,a subject is proposed based on up-conversion luminescence immunity analysis principle. It will make full use of the comprehensive knowledge of multiple disciplines including electronics,photonics,mechanics and so on,conduct research and development on immune chromatography test paper strip up-conversion luminescence detection system driving. The main contents include optical system design,platform drive system design,embedded system design,computer system design. After experiments,it has good stability and measurement accuracy,the measurement relative error is less than 1.5%. The test shows that the test system meets the design requirements,and has certain application value.

immune chromatography test strip;up-conversion luminescence;photoelectric detection;embedded system

10.3969/j.issn.1005-9490.2017.06.049

2016-09-25修改日期2017-01-03

TN247

A

1005-9490(2017)06-1588-05

刘超(1991-),男,硕士研究生,研究方向为嵌入式系统,近红外光谱,705458806@qq.com;

王晓荣(1972-),男,汉族,副教授主要研究方向为分析仪器主要研究方向为分析仪器和嵌入式系统,wang@njtech.edu.cn。