人参三醇组皂苷对大鼠急性坐骨神经损伤修复相关蛋白表达的影响

宋昕恬，王 琳，张晶莹，孟令仪，高 峰，张 琨

(1.吉林省疾病预防控制中心，吉林长春 130062；2.吉林省食品药品认证和培训中心，吉林长春 130061；3.吉林大学第二医院,吉林长春 130000)

人参三醇组皂苷对大鼠急性坐骨神经损伤修复相关蛋白表达的影响

宋昕恬1，王 琳2，张晶莹1，孟令仪1，高 峰1，张 琨3*

(1.吉林省疾病预防控制中心，吉林长春 130062；2.吉林省食品药品认证和培训中心，吉林长春 130061；3.吉林大学第二医院,吉林长春 130000)

研究人参三醇组皂苷(PTS)对大鼠坐骨神经急性损伤蛋白表达的影响。建立大鼠坐骨神经挤压损伤模型，随机分为PTS组，模型对照组及空白对照组，每组各10只大鼠；各组均经腹腔注射给药，PTS组损伤后注射PTS；模型对照组，损伤后注射同剂量生理盐水；空白对照组，不损伤坐骨神经，注射同剂量生理盐水。坐骨神经损伤术后30 d，免疫荧光化学染色检测PTS对损伤侧坐骨神经神经丝蛋白(NF-M)、微管相关蛋白-2(MAP-2)、生长相关蛋白(GAP-43)表达的影响，观察PTS对损伤侧神经的影响。大鼠损伤侧坐骨神经NF-M、MAP-2、GAP-43平均光密度表达(9.66±0.99、12.43±1.44、0.344±0.040)与模型对照组(8.21±1.25、11.90±1.14、0.278±0.042)比较有极显著性差异(P<0.01)。PTS可促进坐骨神经损伤大鼠NF-M，MAP-2，GAP-43的表达。

人参三醇组皂苷；坐骨神经；蛋白表达；免疫组化；大鼠

现今坐骨神经损伤是一种较为常见的外周神经损伤性疾病，损伤后极大地降低了患者的生活质量，损伤初期会出现肌肉疼痛、功能障碍等症状，如果未得到及时治疗会相继出现肌无力，肌肉萎缩等症状，但周围神经损伤与中枢神经损伤最大的不同就是有再生的可能。研究发现人参三醇组皂苷(panaxtrol saponin，PTS)的主要成分Rg1、Re、Rf、Rh1是一种强力的神经保护剂，可促进神经元的生长，具有神经保护作用[1]，但还未见报道过对坐骨神经的保护作用。本试验通过免疫荧光化学染色检测Wistar雄性大鼠坐骨神经挤压损伤模型大鼠损伤侧坐骨神经NF-M、MAP-2、GAP-43的表达，观察PTS对损伤侧神经的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

SPF级健康成年雄性Wistar大鼠60只，体重200 g±20 g，由长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供(SCXK-(吉)2011-0004)；动物室由吉林省疾病预防控制中心提供(吉动设字10-1005)；温度21℃±1℃、相对湿度60%±5%；LEICA RM2135石蜡切片机、DM4000B显微镜、ASP300S脱水机，德国徕卡公司产品。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组 60只Wistar大鼠随机分为正常对照组、模型对照组、PTS 100 mg/kg bw剂量组，每组20只，大鼠腹腔注射麻醉，剂量为1% 戊巴比妥钠(5 mL/kg)，常规消毒，右下肢后外侧切口，钝性分离股外侧肌和股二头肌，游离出坐骨神经。模型对照组、PTS 100 mg/kg剂量组两组动物，在距离梨状肌下缘1 cm处，用血管钳扣第3格垂直钳夹神经，保持压迫30 s，造成坐骨神经SunderlandⅢ度损伤模型[2]，正常对照组不做手术，手术结束30 min，PTS 100 mg/kg剂量组腹腔注射PTS，2次/d，连续30 d[3]。

1.2.2 观测指标 PTS对坐骨神经损伤大鼠NF-M、MAP-2、GAP-43的检测，取坐骨神经在40 mL/L甲醛溶液中固定48h→取材→制作蜡块→组织块切片。 0.01 mol/L PBS冲洗、室温孵育、抗原修复、滴加100 mL/L山羊血清，滴加一抗体、二抗，苏木素复染、冲洗、脱水、封片，每组染色过程中均设定不加一抗的空白对照染色。显微镜下观察坐骨神经中NF-M、MAP-2、GAP-43的表达情况，经图象分析最终计算OD值。

1.2.3 统计方法 数据的统计处理采用SPSS11.5统计软件中单因素方差分析进行均值比较，方差齐时，各组间两两比较用LSD法；方差不齐时，各组间两两比较采用Tamhane′s法。

2 结果

免疫荧光化学染色检测PTS对损伤侧坐骨神经NF-M、MAP-2、GAP-43表达的影响，结果术后第30天模型对照组及PTS处理组大鼠坐骨神经中NF-M、MAP-2、GAP-43平均光密度值均高于正常组，有显著性差异(P<0.05)，PTS处理组大鼠坐骨神经中NF-M、MAP-2、GAP-43平均光密度值高于模型对照组，有显著性差异(P<0.05)，说明PTS可促进神经损伤大鼠NF-M，MAP-2，GAP-43的表达。

表1 PTS对大鼠损伤侧坐骨神经NF-M、MAP-2、GAP-43平均光密度表达的影响

注：“a”模型对照组与空白对照组比较,P<0.05；“b”模型对照组与试验组比较,P<0.01。

Note:"a"Model control group compared with the blank control group,P<0.05; "b"Model control group compared with the experimental group,P<0.01.

图1 PTS对大鼠患侧坐骨神经中NF-M表达的影响

A.空白对照组;B.模型对照组;C.PTS处理组

A.Blank control group;B.Model control group;C.PTS group

图2 PTS对大鼠损伤侧坐骨神经NF-M表达的影响(400×)

Fig.2 Effect of PTS on NF-M expression in injured sciatic nerve of rats(400×)

图3 PTS对大鼠患侧坐骨神经MAP-2表达的影响

A.空白对照组;B.模型对照组;C.PTS处理组

A.Blank control group;B.Model control group;C.PTS group

图4 PTS对大鼠损伤侧坐骨神经MAP-2表达的影响(400×)

Fig.4 Effects of PTS on expression of MAP-2 in injured sciatic nerve of rats(400×)

图5 PTS对大鼠患侧坐骨神经GAP-43表达的影响

A.空白对照组;B.模型对照组;C.PTS处理组

A.Blank control group;B.Model control group;C.PTS group

图6 PTS对大鼠损伤侧坐骨神经GAP-43表达影响(400×)

Fig.6 Effect of PTS on expression of GAP-43 in injured sciatic nerve of rats(400×)

3 讨论

人参自古就是名贵中药材，五加科植物。被誉为“滋阴补生，扶正固本”之极品，有补元气、安神智，生津养血之功效[4]。人参含有多种皂苷和多糖类成分，其中皂苷类能增强大脑皮层的兴奋性，平衡中枢神经系统的兴奋和抑制过程。其中人参三醇组皂苷主要包括Re、Rf、Rg1、Rg2、Rh1、20-葡糖基-Rf、三七皂苷R1、三七皂苷R4等单体[5-6]。有研究结果表明，这些单体可以调节神经营养及生长等因子促进轴突的再生，有保护神经的作用[1]。Rb1和Rg1单体在针对应激、缺血、缺氧等多种因素导致的神经细胞的损伤也有较好的保护作用[7]。NF-M在神经元轴突再生修复中起重要作用，它是神经元胞体、神经轴突细胞的主要成分，可以提示神经元细胞生长的状态。有研究表明，神经受到损伤机体自然修复过程中，神经细胞发生氧化应激反应后，NF-M的表达明显改变，促进神经元功能恢复[8-9]。GAP-43是一种热稳定的磷酸蛋白，多分布在神经元内，对于损伤的神经它可以使其再生、发育并加快结构重建。微管结构蛋白MAP-2是功能及结构蛋白，又被称为神经生长和修复相关蛋白，是神经元轴突和树突的组成部分，在延长和增强神经元结构的稳定性和维持神经元形态和突触可塑性方面起到主要作用。在神经元受损后MAP-2的表达降低，在随后的神经元修复和重建时MAP-2的表达明显升高。在正常情况下神经中的GAP-43及MAP-2表达量很小，当神经受到损伤时GAP-43表达开始升高，当神经开始自我修复时GAP-43、MAP-2表达明显升高，这些变化发生在神经受损后的30天内，直至损伤神经修复完成后GAP-43、MAP-2表达水平恢复至正常[10-13]。由此可见在研究神经系统的可塑性、神经的生长及再生时，常选泽GAP-43和MAP-2作为研究对象，它们在神经损伤修复和结构重建时，起到重要的积极作用。

综上所述，关于PTS在大鼠坐骨神经损伤后的修复作用的研究目前尚未见报道。本课题组在前期通过对PTS 100、50、25 mg/kg 3个剂量组的研究，发现只有100 mg/kg剂量组对急性损伤的坐骨神经有保护作用[14]，本试验只选用100 mg/kg剂量。本课题组还发现伤侧腓肠肌湿重及腓肠肌恢复率PTS处理组明显优于模型对照组。PTS处理组与模型对照组比较，坐骨神经神经纤维排列更整齐，轴索更清晰，雪旺细胞基本保持正常；腓肠肌肌细胞直径更均匀，胞核更清晰，数量增多；故PTS对大鼠坐骨神经急性病理损伤有一定的修复作用[15]。通过本试验的结果可以观察到，造模后第30天模型对照组及PTS处理组大鼠坐骨神经中NF-M、MAP-2、GAP-43平均光密度值均高于正常组，有显著性差异(P<0.05)，PTS处理组大鼠坐骨神经中NF-M、MAP-2、GAP-43平均光密度值高于模型对照组，有显著性差异(P<0.05)，说明人组皂苷可促进神经损伤大鼠NF-M、MAP-2、GAP-43的表达。因此，PTS对大鼠坐骨神经急性损伤有一定的修复作用，这不仅填补了国内相关外研究的空白，同时为PTS在坐骨神经损伤后的功能恢复时的临床辅助治疗提供科学依据。

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2017-05-22

吉林省卫生计生委科研计划项目(2012Z026)

宋昕恬(1979-)，女，吉林长春人，副主任医师，硕士，主要从事食品毒理学研究。*

S852.2

A

1007-5038(2017)12-0078-04