伪狂犬病毒的分离鉴定

姚 红 （山东省东平县畜牧兽医局 271500）

伪狂犬病毒的分离鉴定

姚 红 （山东省东平县畜牧兽医局 271500）

本研究对疑似伪狂犬病猪的病料进行分离鉴定，通过细菌学鉴定、病毒提取培养、电镜观察、动物试验和中和试验。结果表明，所取病料分离鉴定出伪狂犬病毒。

伪狂犬病毒 分离 鉴定

猪的伪狂犬病是由狂犬病病毒(PRV)引起的一种危害严重的急性败血性传染病，主要以新生仔猪的急性死亡及4周龄以上的仔猪表现神经病状为特征。

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1 病料 在周边猪场采集临床表现有发热、昏迷、神经症状等症状的疑似伪狂犬病的死猪中，在脑部取样。细胞株 猪肾传代细胞(PK-15)，由吉林大学畜牧兽医学院病理实验室保存。

1.1.2 主要试剂 健康猪的经脉血液，采自附近猪场；葡萄糖、氯化钠、枸橼酸钠、枸橼酸、氯化钾、碳酸氢钠、氢氧化钠、无水乙醇、青霉素、链霉素、酚红、DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)粉剂；胰蛋白酶，购自长春宝泰克生物制品有限责任公司；胎牛血清(FCS)，购自中国医学科学院血液学研究所。

1.1.3 主要器材 各型微量可调移液器、生物显微镜、96孔培养板、WZ-2A微量振荡器、DK-8D型电热恒温箱、PCR扩增仪(Gene Amp PCR System 9600,Biometra)、TY600C型电泳仪、电泳槽，凝胶成像系统，70P-72型超速离心机，DW-40L262型立式医用冰箱，GZX-9070 MBE数显鼓风干燥箱，BS124S型电子分析天平，DL-CJ-IN型超净工作台，MCO-17AI型CO2培养箱，JEM-1200EXII投射电子显微镜，数码照相机，一次性滤器(仪器精密度为0.22µm)。

1.1.4 各种溶液的配制 DMEM营养液的配制、D-Hanks液的配制、0.25%的胰酶的配制、PBS液的配制、革兰氏染色液的配制(结晶紫溶液、(路)卢戈碘液、脱色剂、番红花红染色液)，以上液体由试验组配制完成。

1.2 方法

1.2.1 细菌学鉴定 将病猪脑部病料触片在显微镜下观察。首先将触片固定，用草酸铵结晶紫染色1min。然后自来水冲洗，加碘液覆盖涂面染色1min。水洗，用吸水纸吸去水分加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，30s后水洗，吸去水分。番红染色液染10s钟后，自来水冲洗。最后干燥镜检。

1.2.2 病毒的粗提 取脑部病料用Hanks液配制成1：10的乳剂，离心10min，取上清，经0.22μm微孔滤膜无菌滤过后准备接种。

1.2.3 细胞培养 把PK-15细胞接入100ml的细胞瓶内并加入细胞培养液进行培养，把细胞瓶置于培养箱中(37℃，5%CO2)培养,观察细胞的生长状态，待到细胞基本长满单层时进行传代，具体方法是倾弃细胞旧液，用Hanks液洗涤2～3次，之后加入0.25%的胰酶(以浸没细胞单层为佳)进行消化，待细胞将要分离而呈圆粒时，加入细胞维持液终止消化，用刻度吸管反复吹打细胞，直至完全分散，重新悬浮细胞，按一传而接入新的细胞瓶中，置于培养箱(37℃，5%CO2)培养。

1.2.4 电镜观察 在长成单层新鲜的PK-15细胞上按1/100剂量分别接种病毒株，37℃吸附1h，(中间轻轻摇晃两次使充分接触)，弃上清，用Hanks液轻轻润洗一次，然后加入细胞维持液。于37 ℃ 5%CO2培养箱中培养，接毒12h后开始，每6h观察细胞病变(CPE)，培养96h。盲传3代至CPE出现80%以上时收获病毒液。

1.2.5 蔗糖梯度离心的方法提纯病毒 （1）将上述经过病毒增殖的细胞培养液,用玻璃匀浆器充分研磨后制成悬液,经反复冻融3次后，置-20℃冰箱中，备用。（2）先以5000g离心15min后，获取上清夜，然后再20000g高速离心30min后取上清夜。（3）接着100，000 g超速离心2h，将沉淀用少量STE溶解。（4）先在超速离心管中加入5～8ml的第3步所获取的含病毒样品的溶解液，然后在离心管中依次加入30%、45%、60%的蔗糖，加的时候是用长针头从底部往上加的。110000g离心2.5h，发现在30%与45%以及45%与60%之间都有一条明亮的带，用长针头将两条不同部位的带都吸取出来，分别收集到不同的瓶内。（5）去蔗糖：用STE缓冲液适量稀释纯化的病毒，然后110000g离心3h，用少量STE(根据沉淀的量决定加入多少)缓冲液把沉淀悬起，即最后获得了纯化的病毒。-20℃冻纯备用，用时可用分光光度计测定其病毒含量。

1.2.6 TCID50测定 在长成单层新鲜的PK-15细胞上按1/100剂量分别接种病毒株，37℃吸附1h，(中间轻轻摇晃两次使充分接触)，弃上清，用Hanks液轻轻润洗一次，然后加入细胞维持液。于37 ℃ 5%CO2培养箱中培养，待CPE达80%时收获病毒液，-70℃冻存。采用微量法测定病毒在PK-15细胞上的感染力。病毒液做10倍系列稀释(从101～1010)后，分别接种于长满单层细胞的96孔微量细胞培养板上，每个稀释度接种8孔，每孔(1～11孔)100µl,12孔加维持液作为阴性对照，于37 5%CO℃2培养箱中培养，接毒12h后开始，每6h观察CPE，培养96h后判定结果。按照Reed-Muench氏法计算病毒的TCID50。

1.2.7 动物试验 选取易感动物家兔做动物试验，将提纯的病毒注入家兔体内，饲养观察，用健康家兔作对照。

1.2.8 中和试验 采用固定病毒稀释血清法，将PRV Min-A标准阳性血清做10倍系列稀释，使其稀释度为10-1-10-9，然后分别与等量200TCID50混匀，置于37℃作用1h，分别接种96孔细胞板，每个稀释度8孔，每孔0.1ml，同时设PRV Min-A株与标准阳性血清、阴性血清及只加维持液的细胞对照，置5%CO2培养箱37℃培养，连续3日观察细胞病变并记录结果。按Reed-Muench氏法计算血清中和指数。判定标准为待检血清的中和指数大于50，即可判定为阳性，10～49为可疑，小于10为阴性。

2 结果

2.1 细菌学鉴定结果

经过革兰氏染色后，将触片在电镜下观察，没有发现细菌感染。

2.2 电镜观察结果

将提纯的病毒接种于长成单层的PK-15细胞，在第1代观察到CPE，接种病毒后48h：感染细胞变性圆缩，相邻感染细胞迅速聚集，融合成“葡萄状”，形成分散的轮廓不明显的合胞体病灶。有的细胞圆缩、集聚，脱落，细胞层形成大小不等的空洞状病变，有的呈拉网状。而未接种的细胞界限明显，大小均一，呈均匀致密的单层。随着在相应细胞中传代次数的增多，规律性CPE出现时间缩短。经PK-15连传10代，则于接种后约18～24h即可见细胞病变，80%的CPE稳定在20h。

2.3 TCID50测定结果

表1 TCID50测定结果

由上表可以看出该分离毒的TCID50应在10-6～10-7之间，其确切稀释倍数可按下列公式计算，确切稀释倍数=(高于50%的百分数—50)/(高于50%的百分数—低于于50%的百分数)=0.11。由上式获得的0.11加在高于50%死亡的稀释度的对数(6)上，因此该病毒的TCID50应是20µl10-6.11稀释的病毒液。

2.4 动物试验结果

注射提纯的病毒后，饲养观察一段时间，家兔开始表现兴奋不安，食欲下降，后来出现不断低头用舌舔、嘴啃或用爪抓接种部位，明显出现瘙痒症状，接种部位被毛脱落、皮肤潮红、出血，暴露出红色肌肉，体温升高，呼吸急促，最后四肢麻痹，角弓反张，后抽搐而死。

2.5 血清中和试验结果

表2 血清中和结果

3 讨论

本试验从急性死亡病猪脑部分离出的病毒，经过细胞接种试验以及对其毒价进行滴定初步判断其为伪狂犬病毒；经过中和试验阳性血清能够特异中和分离毒，抑制细胞病变；根据PRV gD基因设计的引物对分离毒进行反应，可扩增出特异性条带。以上结果可鉴定分离毒为伪狂犬病毒。

4 结论

（1）在电镜下观察，根据其形态和病理变化确定其为伪狂犬病毒。（2）成功通过血清中和试验、PCR扩增的方法对分离的毒株进行鉴定，确定其为伪狂犬病毒。

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