免疫增强药物“归芪饮”临床剂量的确定

王玉坤 刘文利 王尚明 李 丽 （山东迅达康兽药有限公司 山东 济南 250300）

韩征军 （山东省莱州市柞村畜牧兽医站）

免疫增强药物“归芪饮”临床剂量的确定

王玉坤 刘文利 王尚明 李 丽 （山东迅达康兽药有限公司 山东 济南 250300）

韩征军 （山东省莱州市柞村畜牧兽医站）

为研究归芪饮对鸡免疫增强效果,确定临床用药剂量。选用23日龄非免疫健康罗曼蛋公鸡640羽随机均分6个不同剂量用药组、1个疫苗对照和1个空白对照组，另取60羽设1个疫苗对照组和1个空白对照组，30羽/组，除空白对照组外均用新城疫Ⅳ系苗滴鼻、点眼免疫(3羽份/羽)，37日龄二免。结果显示，各组给药后未见任何不良反应，各剂量组在各时间点的抗体效价多明显或显著高于疫苗对照组和空白对照组，1g/ml剂量组鸡只末重显著增加，1g/ml、1.5g/ml剂量组日增重显著高于对照组，料重比显著低于对照组，2g/ml剂量组料重比显著低于对照组；1.5g/ml组的攻毒保护率最高，其次为1g/ml剂量组；体外试验结果显示，归芪饮在合适的剂量可以刺激外周血T淋巴细胞增殖。表明归芪饮临床应用安全，增强细胞免疫和体液免疫的效果确实，可以将1～2g/ml剂量作为临床试验应用剂量，1g/ml剂量最佳。

归芪饮 临床给药反应 抗体效价 生长性能 攻毒保护 体外增殖

归芪饮是以当归、黄芪、淫羊藿、山楂、枸杞、苍术六味中药经过现代工艺提取制成的口服液，是一种具有免疫增强作用的复方制剂。药效试验已经证实归芪饮具有较佳的免疫增强作用，能够有效提高鸡体的体液免疫功能，显著增强新城疫疫苗的免疫效果。本试验进一步观察了系列剂量的归芪饮对鸡的给药反应和对新城疫苗免疫效果的影响，及其在体外对T淋巴细胞增殖作用的影响，旨在确证归芪饮的安全性和药理作用，并为临床试验筛选出最佳剂量。

1 材料与方法

1.1 试验药物 试验药品由山东迅达康兽药有限公司提供。分别将药液配制成浓度为0.5、1、1.5、2、2.5、3g/ml。

1.2 疫苗和毒株 新城疫IV系疫苗(LaSota株)，新城疫检测抗原，用新城疫IV系弱毒苗。新城疫强毒株，由山东农业大学提供。

1.3 主要试剂 淋巴细胞分离液。植物血凝素(pHA)，Sigma分装，用RPMI1640培养液配制成0.5mg/ml，0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，分装-20℃保存。四甲基偶氮蓝(MTT)溶液(Sigma进口分装)，用pH值7.4的PBS配成成5mg/ml的溶液，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装，4℃避光保存。裂解液，二甲基亚砜(DMSO)，Sigma分装。

1.4 动物分组及处理 1日龄非免疫健康罗曼蛋公鸡饲养至23日龄(平均体重161g/羽，平均母源抗体效价3.5Log2)时，取640羽随机均分为8组，每个组4个重复，分别为6个不同剂量用药组、1个疫苗对照和1个空白对照组；另取60羽设1个疫苗对照组和1个空白对照组，30羽/组，隔离饲养，除2个空白对照组外均用新城疫Ⅳ系苗滴鼻、点眼免疫(3羽份/羽)，37日龄二免。在首次免疫的同时，6个用药组分别饮水添加6种浓度的的归芪饮(即分别为每羽0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5g生药量)，0.5ml/羽，1次/d，连续3d。然后进行临床观察和免疫效果测定。分别于首次免疫后第7(D7)、14(D14)、21 (D21)、28(D28)、35(D35)、42(D42)天，每组随机抽取20羽，翼下静脉采血，分离血清，用β-微量法检测血凝抑制(HI)抗体效价。于免疫后第2、4、6周各组随机抽取 20只称取体重，每个重复5只。自由采食饮水，计算各组平均日增重和料肉比。

1.5 攻毒保护试验 于首次免疫后第8周用新城疫尿囊液进行人工攻毒。试验共设8个组：0.5、1、1.5、2g/ml4个剂量组(50羽/组)，1个疫苗攻毒对照组(50羽/组)，1个空白攻毒对照组(50羽/组)，1个疫苗对照组(30羽/组)和1个空白对照组(30羽/组)。攻毒剂量为10-7鸡胚尿囊液，0.5ml/羽。攻毒后观察临床症状和病理变化，并比较其严重程度，记录发病数、存活数。待鸡群死亡率稳定后结束观察。

1.6 体外试验 成年鸡无菌采血，分离淋巴细胞，活细胞计数后，用RPMI1640培养液调整细胞浓度为5×106个/ml，加入到96孔细胞培养板中，80μl/孔，分别加安全浓度范围内5个浓度的归芪饮溶液100μl，协同刺激时每孔再加20μlPHA，每个浓度重复4孔，然后置于38℃、5%CO2条件下培养44h后取出，每孔加MTT20μl，继续培养4h后，吸弃上清液，每孔加DMSO100μl，将细胞板置于微量震荡器上震荡5min 使沉淀完全溶解，检测其在570nm处吸光度(A570值)。

1.7 数据处理 数据用平均数±标准差表示，用SPSS软件比较各组间的差异。

2 结果与讨论

2.1 临床表现 各剂量组给药后，未见任何不良反应。整个试验期间，各组鸡只精神活泼、采食、饮水和粪便正常，未出现发病和死亡，未见任何不良反应。

2.2 生长性能变化 表1结果显示，0.5、0.75g/羽剂量组的第2、4周体重均显著高于(P＜0.05)疫苗对照和空白对照组。1g/羽剂量组在第4周体重显著高于(P＜0.05)疫苗组和空白对照组。第6周时，第0.5g/羽组体重显著高于(P＜0.05)疫苗对照组。而2、3组体重没有差异；0.5g/羽、0.75g/羽剂量组的总的日增重显著高于(P＜0.05)疫苗对照组和空白对照组。0.25、1.25和1.5g/羽总日增重显著低于(P＜0.05)疫苗对照组；0.5、0.75和1.0g/羽组料重比显著低于疫苗对照组和空白对照组(P＜0.05)。所以，0.5、0.75g/羽剂量组均能显著提高鸡体重，降低料重比。但低剂量和最高剂量对生长没有促进作用，还有一定抑制作用。

表1 各组体重变化 (g)

2.3 血清抗体效价的变化

表2 各组血清ND-HI抗体效价的变化 (log2)

表2结果显示，归芪饮各剂量组在绝大多数时间点的抗体效价均高于免疫对照组。0.75g/羽组的抗体效价在所有时间点均显著高于免疫对照组(P＜0.05)，0.5g/羽组在除第7天和第35天外均显著高于免疫对照组(P＜0.05)。1.0g/羽、1.25g/羽和1.5g/羽组的抗体效价在所有时间点均明显或显著低于0.75g/羽组，但这三组间则差异不显著(P＞0.05)。首免后第7天，0.75g/羽组的抗体效价最高，显著高于免疫对照组和其他各方剂组(P＜0.05)，其次为1.5g/羽组；第14天，0.5g/羽组的抗体效价最高，显著高于免疫对照组和其他各方剂组(P＜0.05)，其次为0.75g/羽组，显著高于除1.5g/羽组外的其他各组(P＜0.05)；第21天和第28天，0.75g/羽组和0.5g/羽组抗体效价相当，显著高于免疫对照组和其他各剂量组(P＜0.05)；第35天和第42天，0.75g/羽组抗体效价最高，显著高于免疫对照组(P＜0.05)。

2.4 攻毒保护率测定

表3 攻毒保护试验各组死亡数和死亡率 (羽、%)

由表3结果可以看出，中药复方各剂量组的死亡率均低于疫苗攻毒对照组，保护率均高于疫苗攻毒对照组。0.75g/羽组的死亡率最低，保护率最高，其次为0.5g/羽组，1.0g/羽组，说明该中药复方在高、中剂量时能提高机体对新城疫病毒的抵抗力。0.25g/羽组死亡率高，保护率低，说明剂量较低时保护效果较差。

2.5 体外试验结果

表4 体外最大安全浓度测定结果(A570值) (µg/ml)

表4结果显示，归芪饮在125～1000μg/ml时，A570值显著低于细胞对照组(P＜0.05)，在1.95μg/ml时，A570值显著 高 于 细 胞 对 照 组 (P＜0.05)， 在 0.98μg/ml， 3.91～62.5μg/ml时，A570值高于细胞对照组，但和细胞对照组差异不显著(P＞0.05)。因此可以将62.5μg/ml作为归芪饮的最大安全浓度。

表5 归芪饮单独和协同PHA促进T淋巴细胞的增殖作用结果(A570值) (µg/ml)

根据最大安全浓度测定结果，进行了归芪饮对T淋巴细胞的体外刺激试验。由表5的结果可以看出，归芪饮单独作用时，在3.91～31.25μg/ml时，A570值显著高于细胞对照组(P＜0.05)，说明在3.91～31.25μg/ml时归芪饮可以显著促进淋巴细胞增殖。归芪饮协同PHA共同作用时，在7.81～62.5μg/ml范围内，A570值高于细胞对照组，但和细胞对照组差异不显著(P＞0.05)，说明在7.81～62.5μg/ml时归芪饮可能协同PHA促进淋巴细胞增殖，但其作用不显著。

3 讨论

（1）结果表明，临床给药后，各剂量组未见任何不良反应。试验期间各剂量组鸡只精神活泼、采食、饮水和排便正常，未出现发病和死亡。中剂量组鸡只不但未见任何不良反应，而且鸡的生长最好，体重增加明显。表明归芪饮临床应用安全，且在合适的剂量能显著提高鸡只的生长性能。许多试验研究也表明，中草药在提高动物生长性能、增强机体免疫力、防治动物疾病等方面具有良好的效果[1-3]。孙永梅等试验结果也表明，在日粮中添加党参、黄芪、甘草等中草药，可提高饲料效率，提高肉仔鸡的生产性能[4]。（2）抗体效价测定结果显示，归芪饮各剂量组在绝大多数时间点的抗体效价均高于免疫对照组，1、1.5g/ml组的抗体效价最高；攻毒保护试验结果也显示出，归芪饮在0.75g和1.0g时的保护率较高，表明归芪饮在合适的剂量能显著提高新城疫疫苗免疫雏鸡的血清抗体效价，提高机体对新城疫病毒的抵抗力。邱妍等[5]研究发现，合适剂量的多糖能显著增强雏鸡的特异性免疫应答反应，提高疫苗的免疫力，使抗体产生早、上升速度快、高峰持续时间长。这个结果与Wang等[6]报道的重要有效成分复方能够增强免疫雏鸡的体液免疫是一致的。本试验结果也与这些报道相一致。（3）体外T淋巴细胞增殖结果显示，归芪饮在3.91～62.5μg/ml时对细胞基本无毒害作用。在3.91～31.25μg/ml单独作用时可以显著促进淋巴细胞增殖，协同PHA共同作时，在7.81～62.5μg/ml范围内可能促进T淋巴细胞增殖。表明归芪饮在体外有刺激淋巴细胞增殖的效果，可能提高机体的细胞免疫功能。目前已有不少研究报道了黄芪及其活性成分APS具有良好的免疫增强作用。APS等中药成分在一定浓度既能单独又能协同ConA或LPS刺激淋巴细胞增殖[7]。聂小华等[8]的试验结果进一步证实了APS对于ConA诱导的脾脏、胸腺T淋巴细胞增殖具有显著的促进作用。4 结论

试验结果可以表明，归芪饮能够显著增强体液免疫和细胞免疫，提高机体的免疫力和生长性能。归芪饮临床应用安全，体内增强体液免疫和体外增强细胞免疫的效果确实。体内每羽0.5～1g(1～2g/ml剂量组)剂量作用效果都好，从作用效果和用药成本考虑，推荐0.5g/羽可以作为临床试验应用的最佳剂量。

[1] 夏中生, 封伟贤, 钟炜等. 3中添加剂对良风花雏鸡生长性能及血液生化指标的影响[J]. 畜牧与兽医, 2005, 37(9)： 19-22.

[2] 祝国强, 钟翠红, 林冬梅等. 中草药添加剂对肉鸡生产性能及生化指标影响的试验研究[J]. 饲料博览, 2005(6)： 38-39.

[3] 祝国强, 杜云良, 王斌等. 复方中药对肉鸡生产性能和生化指标的影响[J]. 中国家禽, 2004,26(15)： 24-27.

[4] 孙永梅, 王星, 刘显军. 复方中草药对AA肉鸡生产性能及肉品质的影响[J]. 江苏农业科学, 2009(2)： 201-203.

[5] 邱妍, 崔保安, 胡元亮等. 4种多糖对免疫雏鸡抗体效价和 T 淋巴细胞的影响[J]. 南京农业大学学报, 2008,31(1)： 77-81.

[6] Wang Deyun, Hu Yuanliang, Sun Junling, et al. Comparative studyon adjuvanticity of compound Chinese herbal medicinal ingredients[J].Vaccine, 2005, 23(28)： 3704-3708.

[7] 王德云, 胡元亮, 孔祥峰等. 中药成分对培养的鸡脾脏淋巴细胞增殖的影响[J]. 畜牧兽医学报, 2005,36(11)： 1210-1214.

[8] 聂小华, 史宝军, 敖宗华等. 黄芪多糖的提取及其对淋巴细胞增殖的影响[J]. 安徽农业大学学报, 2004, 31(1)： 34-36.

S853.92

A

1007-1733(2017)12-0004-03

2017-08-17）