MTHFRC677T基因多态性及血浆同型半胱氨酸与高血压合并缺血性脑卒中的相关性研究

刘 宇,隋小芳*,王凤玲,黄佳滨,范巧菊,董天崴,苏亚楠,费秀斌,杨 泽

(1.佳木斯大学附属第一医院 老年病科，黑龙江 佳木斯154002;2.佳木斯大学附属第一医院 心内科;3.佳木斯大学附属第一医院 科研科;4.北京医院老年医学研究所)

MTHFRC677T基因多态性及血浆同型半胱氨酸与高血压合并缺血性脑卒中的相关性研究

刘 宇1,隋小芳1*,王凤玲1,黄佳滨1,范巧菊1,董天崴2,苏亚楠3,费秀斌1,杨 泽4

(1.佳木斯大学附属第一医院 老年病科，黑龙江 佳木斯154002;2.佳木斯大学附属第一医院 心内科;3.佳木斯大学附属第一医院 科研科;4.北京医院老年医学研究所)

目的探讨亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因多态性的基因型和等位基因频率及血浆同型半胱氨酸与高血压合并缺血性脑卒中的相关性。方法首先采用病例-对照研究，随机选取425例研究对象分为对照组(n=104)、高血压组(n=116)、缺血性脑卒中组(n=110)、高血压合并缺血性脑卒中组(n=95)。其次用基因组DNA试剂盒提取DNA，通过聚合酶链反应-高分辨率溶解曲线(PCR-HRM)方法进行基因分型，最后通过统计学方法分析基因型在不同组间的分布情况，并探索影响血浆同型半胱氨酸(Hcy)的因素。结果各实验组C/T、T/T基因型均高于对照组(54.31%-55.45% vs.46.15%)、(27.59%-30% vs.20.19%),差异具有统计学意义(prange=0.001-0.0082)，高血压合并缺血性脑卒中组分别与高血压组以及缺血性脑卒中组比较，CT、TT基因型分布无差别(Prange=0.7-0.8)，年龄因素在和疾病的共同影响下对Hcy的影响并不显著(P=0.88)。结论MTHFRC677T基因型C/T或T/T会增加患高血压病、缺血性脑卒中以及高血压合并缺血性脑卒中的风险，基因型C/T或T/T比增龄对Hcy增高的影响更显著。

高血压合并缺血性脑卒中；易感基因；亚甲基四氢叶酸还原酶；血浆同型半胱氨酸

(ChinJLabDiagn,2017,21:2056)

高血压(hypertension，HTN)是一种常见的慢性非传染性疾病，是多基因、多因素引起的高度异质性疾病[1-3]。血压(blood pressure，BP)升高在2001年造成全球约760万例高血压患者的死亡，占所有死亡者的13.5%[4-8]。据统计，2008年有9.78亿成年人(占世界成年人口的28%)的高血压患者未得到控制[8]。在北美成年人群中，高血压的发病率大约为34%[8]，来自美国和欧洲的流行病学数据表明，只有38.8%的欧洲高血压患者和50.1%的美国人达到了治疗目标[9,10]，到2025年全球高血压患病率将超过15亿[8]。HTN始终被认为是心血管疾病和肾脏疾病的主要危险因素[7,8]。

缺血性脑卒中(Ischemic stroke，IS)是世界上导致死亡或残疾的主要原因，是中国人群的主要死亡原因，也是世界人群第二大死因[11]。世界卫生组织(WHO)报告，全世界每年有1500万人患有卒中，其中500多万人死亡，另有500万人因残疾而死亡[11]。MTHFR是Hcy代谢中的重要酶[11]，而MTHFR C677T多态性(rs1801133)导致丙氨酸被缬氨酸(A222V)取代，这种错义突变导致酶的活性降低和Hcy水平升高。Hcy的升高不仅与高血压有关，而且也会增加卒中的风险[12]。近年来，已经报道了许多有关基因多态性与高血压或卒中相关的研究[13]，但缺乏全面和综合的研究来探讨MTHFR基因多态性与高血压合并缺血性脑卒中的关系，此外并没有深入的探索影响Hcy水平的因素。因此，我们旨在探讨MTHFR基因多态性的基因型和等位基因频率与高血压合并缺血性脑卒中的相关性，并进一步探索影响Hcy的因素。

1 材料与方法

1.1研究对象

本项病例对照研究共纳入425例受试者，为2016年10月至2017年3月在佳木斯大学附属第一医院就诊的患者，分别包括健康对照组104例，高血压病组116例、缺血性脑卒中组110例和高血压合并缺血性脑卒中组95例。健康对照组的纳入标准为佳木斯大学附属第一医院经相关检查除外高血压、卒中及其它慢性疾病的健康人群，同时满足无相关疾病的家族史。其中男性53例、女性51例，平均年龄55.65±11.39岁。高血压病组纳入标准符合2014年高血压防治指南，缺血性脑卒中纳入标准参照2014年《中国脑血管病防治指南》中华医学会神经科学分会制定的《各类脑血管疾病诊断要点》中有关脑梗死诊断标准为依据，高血压合并脑卒中纳入标准同时满足高血压和脑卒中的纳入标准。以上研究对象是我国佳木斯地区无血缘关系的汉族人，本项研究已通过佳木斯大学附属第一医院伦理委员会批准并取得受试对象的知情同意书。

1.2主要实验仪器和试剂

基因组 DNA 提取试剂盒、限制性内切酶 MIu I、聚合酶链反应引物(北京擎科生物有限公司)、LC-green PLUS 饱和荧光染料、HRM Light Scanner TMHR-I 96 仪 (美国 Idaho 公司)、Nanodrop ND-1000 分光光度计(美国 Thermo 公司)、PCR 扩增仪 c-1000。

1.3样本的采集和DNA的制备

记录所有受试者的性别、年龄等，清晨空腹后测血浆同型半胱氨酸、甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、空腹血糖、尿酸及肌酐，天门冬氨酸氨基转移酶，丙氨酸氨基转移酶。留取5mlEDTA抗凝静脉血用DNA提取试剂盒提取DNA，质控后将所有样本的DNA 浓度用ddH2O标化至90-120 ng/μl 之间，4 ℃保存备用。

1.4MTHFR的HRM基因分型

1.4.1设计引物 使用NCBI数据库下载MTHFRC677T SNP所在的DNA序列信息，结合使用Primer Premier5.0和Oligo6.0进行引物设计，上游引物：GGAGAAGGTGTCTGCGGGAG；下游引物：CAAAGAAAAGCTGCGTGATGATGA。送由北京擎科生物有限公司合成后溶解待用。

1.4.2PCR反应 扩增条件为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性20 s，64.1 ℃复性20 s，72 ℃延伸4 s，再重复第2-4步45个循环；最后再72 ℃延伸1 min，95 ℃变性1 min，复性1 min，重复第7-9步2个循环。最后2个循环是进行HRM分析之前的变性复性处理，使异源双链形成。

1.4.3PCR产物的HRM分析 将PCR产物移入经Light Scanner仪专用96孔扫面班中，8 000 rpm离心5 min后放入Light Scanner仪中进行高温信号采集。用Light ScannerCall IT软件对采集后的曲线进行数据分析。

1.5统计学处理

使用SPSS 19.0软件进行统计学处理，用Hardy-Weinberg平衡检验验证样本的群体代表性，P>0.05为符合HWE。研究样本均值的组间比较使用成组t检验，分类变量用频数代表，不同基因型之间比较采用χ2检验，通过多元线性回归分析影响Hcy的因素。

2 结果

2.1对照组、高血压组、缺血性脑卒中组以及高血压合并缺血性脑卒中组在性别比例、年龄组成方面无差异，具有可比性(P>0.0083)(见表1)。与对照组比较，高血压组、缺血性脑卒中组和高血压合并缺血性脑卒中组的Hcy、TG、TC、LDL、FBG、ALT、AST、CR、SBP、DBP均高于对照组，而HDL实验组低于对照组， CR、SBP、DBP在高血压组中高于对照组，差异具有统计学意义。TG、FBG在脑卒中组较对照组中高，差异有统计学意义。其他临床指标无显著性差异(P>0.05/6≈0.0083)。

表1 受试对象一般临床基本指标在对照组和病例组(高血压组、缺血性脑卒中组和高血压合并缺血性脑卒中组)间的比较

注：M：男性，F：女性， Hcy：血浆同型半胱氨酸，TG：甘油三酯，TC：总胆固醇，LDL：低密度脂蛋白胆固醇，HDL-C：高密度脂蛋白胆固醇，FBG：空腹血糖，UA：尿酸， CR：肌酐，ALT：丙氨酸氨基转移酶， AST：天门冬氨酸氨基转移酶，SBP：收缩压，DBP：舒张压，PP：脉压差。*表示对照组和病例组之间的比较，差异具有统计学意义，P<0.0083有统计学差异。

2.2DNA试剂盒提取人全血基因组DNA经HRM分型后的基因型结果

MTHFRC677T基因多态性经PCR-HRM基因分型方法得到三种基因型见图1，分别是：解链温度最低的T/T纯合子，解链温度最高的C/C纯合子以及解链温度居中的C/T杂合子。

2.3MTHFRC677TSNP位点哈迪温伯格平衡检验

将本研究中SNP分别在对照组、高血压组、缺血性脑卒中组和高血压合并缺血性脑卒中组进行了哈迪温伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium HWE)检验(表2)，发现所有SNP位点的基因型频率均符合HWE(P>0.05)，说明入选的研究人群具有群体代表性。

表2 MTHFRC677T基因多态性的哈迪温伯格平衡分析

图1 MTHFRC677T基因多态性经PCR-HRM基因分型的三种基因型及解链温度

2.4MTHFRC677T基因型和等位基因频率在各组间的分布比较

在显性模型中，不同组间MTHFRC677T基因多态性的基因型和等位基因频率分布见表3。和对照组相比，高血压组中CC基因型频率低于对照组(18.10% vs.33.65%)，而CT、TT基因型均高于对照组(54.31% vs.46.15%,27.59% vs.20.19%),差异具有统计学意义(P=0.0082)，等位基因T频率高于对照组(54.74% VS.43.27)。缺血性脑卒中组和对照组比较，CT、TT基因型均较高(55.45% vs.46.15%,30% vs.20.19%)，差异显著(P=0.001),T等位基因频率显著高于对照组(57.72% vs.43.27%,P=0.003)。在高血压合并缺血性脑卒中组，CT、TT基因型比对照组高(54.74% vs.46.15%,29.47% vs.20.19%),P=0.004,T等位基因在高血压合并缺血性脑卒中组56.84%高于对照组43.27%，差异显著(P=0.007)。其他组间比较差异无统计学意义(Prange=0.46-0.8)。

表3 显性模型中不同组中MTHFRC677T基因多态性的基因型和等位基因频率分布

注：4个组间指标的两两比较，采用Bonferroni校正法，校正后的检验水准为α‘=0.05/6=0.0083。

2.5以Y=b0Xb1为模型，建立Hcy与年龄之间的幂函数关系，如图2所示，随着年龄的增长，Hcy表现出逐渐增高的趋势。

2.6以Hcy为应变量，多元线性回归的结果如表4所示，探究年龄、疾病以及基因型和Hcy之间的关系。在疾病和基因型等因素的作用下，增龄对Hcy的影响并不显著。

3 讨论

MTHFRC677T基因多态性与高血压、缺血性脑卒中易感性有关，基因型C/T或T/T会增加患高血压以及缺血性脑卒中的风险。众所周知，高血压是造成心血管疾病(CVD)和全球死亡率的主要危险因素，而降低血压的因素被证明可以降低心血管疾病的风险[14,15]。来自全基因组关联研究(genome-wide association study，GWAS)和流行病学研究的证据提出编码高血压中叶酸代谢酶亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)的基因，即MTHFR中常见的677C/T多态性不仅与高血压风险增加有关，而且会导致CVD的高风险，尤其是脑卒中[15]。来自流行病学研究的证据表明，常见的MTHFR 677C /T多态性使CVD的风险总体上升到40%[14]。此外，不同地理区域之间的研究显示与该遗传变量相关的CVD风险程度差异很大;亚洲和中东人群早期的荟萃分析探讨了这种多态性与心血管疾病的关系，显示北美人群的遗传风险并不显著，而MTHFR 677TT基因型则显著增加世界其他地方心血管疾病的风险[14]。随后的Meta分析研究了卒中的风险，并表现出较强的相关性[15]。一项关于卒中风险荟萃分析提供了近60,000例卒中事件的数据，其中包括20885例卒中事件，其总体风险增加了37%[13]。

图2 Hcy与年龄之间的幂函数关系

项目BSEtP95%CI常数项4．631．742．670．0081．22⁃8．04C/T4．780．746．472．73×10-103．33⁃6．23T/T13．20．8415．753．78×10-4411．53⁃14．82高血压组4．340．805．439．68×10-82．77⁃5．91缺血性脑卒中组3．000．823．682．63×10-41．4⁃4．6高血压合并缺血性脑卒中组7．650．868．931．41×10-175．96⁃9．33年龄0．0040．020．160．880．04⁃0．05

注：以Hcy为连续性变量，MTHFRC/T、T/T、疾病、年龄和Hcy的多元线性回归分析。

此外，本研究结果表明Hcy水平和疾病存在显著相关性，而年龄对Hcy的影响不显著。我们通过建立Hcy与年龄之间的幂函数关系的结果显示，随着年龄的增长，Hcy表现出逐渐增高的趋势。但通过多元线性回归分析，年龄的因素在和疾病的共同结果下表现的并不显著(P=0.88)。导致血浆Hcy增高的主要因素为疾病，年龄并不是主要的因素。在健康的人群中，也会表现出随着年龄的增长Hcy升高的趋势，增龄仅仅只是一小部分因素。随着年龄的增长，高血压、卒中的发生的风险会增加，而这种变化可能会让我们误以为是Hcy水平随着年龄增长的原因，但实际疾病的因素和Hcy增高的关系更为密切。而对疾病的探讨即对疾病易感基因的研究，导致Hcy增高的主要原因可以定位到增加疾病风险的易感基因上，即与MTHFR677CC基因型相比，C/T和T/T可导致Hcy水平升高。

相关研究[15]报道，与CC基因型相比，纯合子TT和杂合子CT基因型分别具有约30%和65%的MTHFR酶活性。血浆Hcy水平可以用来作为诊断H型高血压的标准，同时也是卒中的独立危险因素。Hcy轻到中度升高与冠脉疾病、脑血管疾病、颈动脉内膜厚度等有关，与外周动脉疾病及静脉栓塞等血管疾病相关。最近的一项研究[15]表明，对于高血压患者，补充VitB2，可以有效降低MTHFR 677TT基因型患者的血压。对于具有这种基因型的全球亚洲群体，适量的补充VitB2可以预防或延缓高血压的发展。还需要进一步的研究探讨具体剂量以及治疗周期，为临床诊疗提供更多的方案。

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RelationshipBetweenMTHFRC677TgenePolymorphismsaccompaniedplasmahomocysteineandHypertensionwithIschemicstroke

LIUYu,SUIXiao-fang*,WANGFeng-ling,etal.

(TheFirstAffiliatedHospitalofJiamusiUniversity,Jiamusi154002,China)

ObjectiveThis study was to observe the genotypes and allelea frequencies distribution of MTHFRC677T in hyperyension with Ischemic stroke in a Northeast Han Chinese population.MethodsFirstly,a case-control study was performed in the contral group (n=104),the Hypertension group (n=116),the Ischemic stroke group (n=110) and the hypertension with Ischemic stroke group (n=95) from the First Affiliated Hospital of Jiamusi University between October 2016 and May 2017.Secondly,the genomic DNA was extracted from the peripheral blood by using Genomic DNA kit,and single nucleotide polymorphisms (SNPs) of MTHFRC677T was genotyped by PCR-HRM.Lastly,we applied SPSS19.0 software for data processing and statistical analysis to compare the allele and genotype distribution of SNPbetween the groups and to explore the risk factors of Hcy by using unconditional logistic regression model.ResultsThe genotypes of C/T or T/T in case group were higher than that in control group(54.31%-55.45% vs.46.15%),(27.59%-30% vs.20.19%),and the differences were statistically significant(prange=0.001-0.0082).Compared to Hypertension group,the genotypes distribution of C/T or T/T in hypertension with Ischemic stroke group and Ischemic stroke group were almost the same(Prange=0.7-0.8).The influence of aging on Hcy was not significant under the mixed factors of diseases(P=0.88).ConclusionOur study showed thatsingle polymorphism of CT or TT confer the risk of hypertension with Ischemic stroke.CT or TT can increase the level of Hcy higher than ageing.

Hypertension with Ischemic stroke;Gene polymorphism;MTHFR; Hcy

黑龙江省自然科学基金面上项目(H2015076);黑龙江省教育厅科学技术研究项目(2016-KYYWF-0593)

*通讯作者

1007-4287(2017)12-2056-06

R544.1

A

刘宇(1992-)，女，老年医学在读硕士研究生;隋小芳(1976-)，女，主任医师，硕士研究生导师，主要从事心血管疾病的临床与基础研究。

2017-05-13)