慢性粒细胞白血病附加染色体异常分析

于波海,仁 实,张 萌,柴 淼,苏丽菊,贡铁军,于 鑫,腾 旭

(1.哈尔滨医科大学 生物学博士后流动站，黑龙江 哈尔滨150081；2.哈尔滨市第一医院 检验科，黑龙江 哈尔滨150010；3.哈尔滨市第一医院 血研所，黑龙江 哈尔滨150010；4.大连大学附属中山医院 医学检验部，辽宁 大连116001)

慢性粒细胞白血病附加染色体异常分析

于波海1,2,仁 实3,张 萌2,柴 淼2,苏丽菊2,贡铁军3,于 鑫4,腾 旭1*

(1.哈尔滨医科大学 生物学博士后流动站，黑龙江 哈尔滨150081；2.哈尔滨市第一医院 检验科，黑龙江 哈尔滨150010；3.哈尔滨市第一医院 血研所，黑龙江 哈尔滨150010；4.大连大学附属中山医院 医学检验部，辽宁 大连116001)

目的分析17例Ph1阳性慢性粒细胞白血病患者附加染色体异常克隆演变特征。方法采用常规染色体G显带技术，回顾性分析17例慢性粒细胞白血病患者遗传学资料。结果219例Ph1阳性CML患者，17例附加染色体异常发生率7.8%，其中慢性期10例(6.8%)，加速期3例(7.7%)，急变期4例(11.8%)。结论在CML诊断、治疗及进展过程中，传统的染色体分析技术仍然是检测ACAs的唯一方法，并提示可能的致病性、预后和疗效。

慢性粒细胞白血病；附加染色体异常：核型分析

(ChinJLabDiagn,2017,21:2043)

慢性粒细胞白血病(Chronic myelogenous leukemia,CML) 是一类起源于多功能造血干细胞的恶性克隆性疾病。其诊断特征是9号染色体平衡易位至22号染色体，形成t (9;22) (q34;q11. 2 )，即费城染色体(Philadelphia chromosome,Ph1)形成及BCR-ABL融合基因的产生[1]。根据其断裂位点的不同可分为3种亚型：e13a2 (b2a2)、e14a2 (b3a2)和ela2，分别编码 P210、P230和P190 蛋白，在白血病发生发展中起着极为重要的作用[2]。CML发生、发展过程存在三个阶段：慢性期(chronic phase,CP) 、加速期(accelerated phase,AP) 以及急变期(blast crisis,BC) 。附加染色体异常(additional chromosome abnormalities,ACAs) 经常出现在CML的发生、发展各个阶段以及急性变过程中。大约有8%的Ph1染色体阳性的初诊CML病例可观察到附加染色体异常[3]。本研究，将我单位近十年间17例附加染色体异常CML患者遗传学结果分析汇报如下。

1 对象与方法

1.1 对象

2006-2016年间我院接受治疗的CML患者241例，其中17例患者Ph1+伴附加染色体异常，男性13 例；女性6例；中位年龄43岁；经形态学、遗传学、免疫学、分子生物学检测，参照WHO(2001)标准诊断为CML并分期。临床分期： 慢性期10 例；加速期3例；急变期4例。

1.2 方法

1.2.1染色体分析

全部病例均采集新鲜骨髓标本直接法或不加植物血凝素的短期培养法，制备染色体标本，然后采用姬姆萨G显带技术进行核型分析，全部病例均分析20-40个中期分裂相。参照《人类细胞遗传学国际命名体制(ISCN)》的有关规定，分析染色体变异情况，并进行照相、描述。

1.2.2BCR-ABL(P210)融合基因检测

采集骨髓2 ml，肝素抗凝。将标本沿管壁加到 Ficoll 分离液上层，两者比例为1∶1 2 000 r/ min，室温离心 20 min，吸取中间单个核细胞层，取 1 滴细胞混悬液计数后，收集约 106个细胞沉淀，-80℃备用。按照 Trizol (TaKaRa，中国) 说明书抽提 RNA。应用7500型Q-PCR仪 (ABI，美国)。试剂来源于上海源奇生物医药科技有限公司的 BCR-ABL 融合基因定量检测试剂盒(荧光 RT-PCR 法)，严格按试剂盒说明书操作。实验中同时对 BCR-ABL P210参考品和内参基因参考品进行扩增，分别独立分析， 用获得的相应两条标准曲线，分别得到各标本 BCR-ABL 的检测浓度(A)和内参基因的检测浓度(B)。BCR-ABL 水平 = (A/B)×100%。

2 结果

2006-2016年间我单位门诊及住院CML患者241例纳入本研究，经常规染色体G显带核型分析发现，219例患者Ph1染色体阳性，占 90.9% (219/241) ；17例Ph1染色体阳性患者伴有附加染色体异常，发生率7.8% (17/219)，男女比例11:6，中位年龄43 (21-65)岁；其中慢性期10例，加速期3例，急变期4例 (表1) 。

Ph1+伴ACAs可出现在CML各个阶段，本研究中CML各阶段ACAs发生率及主要核型异常见表2。

表1 17例Ph1+伴ACAs CML患者临床特征

表2 CML各阶段Ph1+伴ACAs发生率及主要核型异常

本研究应用荧光定量PCR技术，比较17例患者BCR-ABL (P210) 融合基因表达水平，结果见表3。结果显示，慢性期BCR-ABL水平显著低于加速期与急变期。

表3 CML各阶段Ph1+伴ACAs患者BCR-ABL(P210)融合基因表达水平

3 讨论

自从1960年Ph1首次被报道以来，其机制正在被大量的细胞遗传性研究结果所揭示。关于CML常规染色体分析报道非常普遍，但是有关Ph1+伴ACAs的报道尚少见。本研究报道17例Ph1+伴ACAs的CML患者染色体异常克隆演变特点。

ACAs与CML疾病进展密切相关，Ph1+伴ACAs意味着CML患者疾病侵袭性进展的加速，传统的染色体分析技术在CML诊断、治疗及进展中发挥的重要作用仍不能被分子生物学方法所替代。本研究中ACAs发生率随着疾病的进展不断增高，预示ACAs在疾病预后中的作用机制可能更加复杂。意大利成人血液病工作小组关于CML前瞻性实验研究结果显示，Ph1+伴ACAs在CML患者细胞生成和分子应答率明显降低，且染色体异常的患者应答时间明显延长，附加染色体异常是使用伊马替尼作为一线治疗的慢性粒细胞白血病患者的一个不良预后因素[4]。据报道，附加染色体为非随机性的，存在主要途径(major-route)及次要途径(minor-route)；主要途径如：双Ph1、+8、+9、i17等；次要途径如：t(3;12)、t t(4;6)、t(1;21)、-Y、-17/+17、+21等。主要途径ACA提示预后较差，临床需要密切观察、及时治疗；次要途径ACA与经典的t(9;22) 预后未见明显差异[5]。

近期研究结果显示，双Ph1、+8、+9、+19、+21、i17是ACA中常见的染色体异常，其中双Ph1、+8及i17出现较为多见。+8、+9、+21易见于在髓系急性变 (myeloid-BC) 患者，而非淋系急性变 (lymphoid-BC) 患者；可能+8更具有急变趋势的预测价值[6]。本研究中急变期患者仅4例，尚未观察到这一现象，推测CML其它阶段出现+8、+9、+21与急变期CML进展趋势相关。更有趣的是，超二倍体多发生于髓系急性变患者；亚二倍体多发生于淋系急性变患者，这与本研究中的3例急变期患者CML进展趋势非常一致。

多项研究证实，CML急变期伴有ACAs预后较差。急变期之前，出现17号染色体异常，提示预后不良；然而8号染色体异常所预示的预后价值目前还存在争议。而众所周知，21三体是唐氏综合征(Down syndrome)的主要特征，本研究中4例CML患者存在21三体，且发生在CML不同阶段，患者为成年或中老年，无智力异常及特殊面容，因此可以排除唐氏综合征。-Y在正常的老年男性健康人群中也可以观察到；因而本研究中-Y发生率有可能被高估；使用伊马替尼治疗的Y染色体缺失CML患者，细胞遗传学、分子生物学反应及总生存明显降低[7]。

本研究中17例患者BCR-ABL (P210) 融合基因检测均为阳性，慢性期BCR-ABL (P210) 融合基因表达水平显著低于加速期与急变期。研究认为BCR-ABL阳性的 CML 患者存在多种类型的基因不稳定性，如：染色体数量改变、假二倍体、DNA 缺失与嵌入等，从而导致了Ph1染色体以外的染色体改变。这些基因的变化是先于BCR-ABL融合基因发生还是由BCR-ABL融合基因引起？ 研究显示基因不稳定性在异常造血干细胞克隆内先于Ph1染色体发生，而BCR-ABL融合基因进一步促进了遗传不稳定性[8]。

本研究中CML患者多半来自外省市，在病例追踪过程中流失较大，因而本研究缺乏伊马替尼治疗后ACAs发生率的比较以及分析；未能计算经历完全细胞遗传学缓解所需时间。本研究还将继续，这样会有更多的CML患者参与其中，在疾病的诊断、各阶段以及伊马替尼治疗过程中，应用分子生物学与细胞遗传学技术，检测ACAs发生与变化，进一步揭示ACAs对CML致病以及预后的影响。

[1]Kurzrock R,Faderl S,Talpaz M,et al. The biology of chronic myeloid leukemia.[J]. New England Journal of Medicine,1999,341(3):164.

[2]Lee J,Kim D S,Lee H S,et al. Concurrence of e1a2 and e19a2 BCR-ABL1 Fusion Transcripts in a Typical Case of Chronic Myeloid Leukemia[J]. Annals of Laboratory Medicine,2017,37(1):74.

[3]Zaccaria A,Testoni N,Valenti A M,et al. Chromosome abnormalities additional to the Philadelphia chromosome at the diagnosis of chronic myelogenous leukemia:pathogenetic and prognostic implications[J]. Cancer Genetics & Cytogenetics,2010,199(2):76.

[4]Luatti S,Castagnetti F,Marzocchi G,et al. Additional chromosomal abnormalities in Philadelphia-positive clone:adverse prognostic influence on frontline imatinib therapy:a GIMEMA Working Party on CML analysis[J]. Blood,2012,120(4):761.

[5]Fabarius A,Leitner A,Hochhaus A,et al. Impact of additional cytogenetic aberrations at diagnosis on prognosis of CML:long-term observation of 1151 patients from the randomized CML Study IV[J]. Blood,2011,118(26):6760.

[6]Mu Q,Ma Q,Wang Y,et al. Cytogenetic profile of 1,863 Ph/BCR-ABL-positive chronic myelogenous leukemia patients from the Chinese population[J]. Annals of Hematology,2012,91(7):1065.

[7]Fabarius A,Leitner A,Hochhaus A,et al. Impact of additional cytogenetic aberrations at diagnosis on prognosis of CML:long-term observation of 1151 patients from the randomized CML Study IV[J]. Blood,2011,118(26):6760.

[8]Muvarak N,Nagaria P,Rassool F V. Genomic instability in chronic myeloid leukemia:targets for therapy?[J]. Current Hematologic Malignancy Reports,2012,7(2):94.

AnalysisofadditionalchromosomalabnormalitiesinPhiladelphia-positivecellswithchronicmyeloidleukemia

YUBo-hai1,2,RENShi3,ZHANGMeng2,etal.

(1.BiologyPost-doctorStation,HarbinMedicalUniversity,Harbin150081,China;2.DepartmentofLaboratoryMedicine,TheFirstHospitalofHarbin,Harbin150010,China;3.InstituteofHematologyandOncology,TheFirstHospitalofHarbin,Harbin150010,China;4.DepartmentofLaboratoryMedicine,AffiliatedZhongshanHospitalofDalianUniversity,Dalian116001,China)

ObjectiveTo investigate the clonal evolution of additional chromosomal abnormalities (ACAs) in Philadelphia-positive cells with chronic myeloid leukemia (CML).MethodsChromosome banding analysis was performed on bone marrow cells after 24 h short-term culture,and using conventional G-banding technique.Results219 patients were enrolled and ACAs occurred in 17 patients(7.8%),6.8% in chronic phase,7.7% in accelerated phase,and 11.8% in blast crisis (BC).ConclusionPerforming classic cytogenetics,both at diagnosis and during the course of the disease,is still the only way to detect the presence of and/or the development of ACAs,along with the possible pathogenetic,prognostic,and therapeutic implications.

Chronic myelogenous leukemia;Additional chromosome abnormalities;Karyotypic analysis

哈尔滨市科学技术局青年后备人才项目(No.2013RFQYJ081) 大连市卫生和计划生育委员会科研项目(No.1611115)

*通讯作者

1007-4287(2017)12-2043-04

R733

A

于波海(1973-)，男，主任检验技师，博士，从事实验诊断学、病原生物学研究。

2017-02-08)