高中生物开放式组织培养实验设计

杨欣悦

摘 要：实验目的：考查不同抑菌剂对愈伤组织的形成有何影响，其次寻找接种方式、取材部位等因素对诱导愈伤组织形成的最佳条件，在组织培养过程中，掌握外植体消毒的注意事项，合理选取和控制培养条件。实验材料：月季花；市售多菌灵和大蒜素。实践方法：培养基配制，消毒，接种，条件设置。实验结果：多菌灵在开放式组培中的抑菌效果好，且两者的成活率都达到或超过了50%。

关键词：开放式组织培养；抑菌剂；效果

中图分类号：G63 文献标识码：A 文章编号：1673-9132（2017）03-0140-02

DOI：10.16657/j.cnki.issn1673-9132.2017.03.090

科学研究表明，植物细胞处于离体状态时，在一定营养物质、激素和其他外界条件的作用下，表现出全能性，能发育成完整植株。高中生物中通过植物的组织培养实验来学习植物的无性繁殖，组织培养是把植物的器官、组织以至单个细胞，使其在人工条件下，继续生长，甚至分化发育成一完整植株的过程，为保证植株成活率，此操作通常在无菌操作环境进行。

在实验的实施过程中，我们发现植株体几乎都受到污染发霉，成活率不到10%，究其原因主要有两个方面：一是班级规模的操作流程不可避免地带来了很多不确定的污染因素，难以达到植物组织培养对无菌要求极为严格的条件；二是在培养的过程中，需要保持恒温的生长环境以及严格的光照时间，对前者尤其有较高的要求。

开放式组织培养是通过在培养基中加入抑菌剂来代替高压灭菌，避免了绝对的无菌环境，使植物在相对开放的条件下可以良好生长。这种方法能够降低植物培养繁殖的成本，目前在多种花卉和经济类作物的工厂化育苗生产实践中已得到推广应用。随着开放式组织培养技术研究的成熟，在高中生物组织培养实验中应用这一方法，能显著提高实验的成功率，改善实验条件，尤其是边远地区学校的实验环境。

选择合适的抑菌剂、外植体是开放式组织培养实验设计的关键要素。参考相关文献资料及中医理论，我们选取了市售多菌灵和大蒜素作为抑菌剂。大蒜素也可采用自制的方法获得，文献[1]提供了相关制作方法及浓度参数。

一、实验目的和方法

实验要求能阅读植物组织培养的相关文献资料，考查不同抑菌剂对愈伤组织的形成有何影响，其次寻找接种方式、取材部位等因素对诱导愈伤组织形成的最佳条件，在组织培养过程中，掌握外植体消毒的注意事项，合理选取和控制培养条件，对实验过程中出现的现象及时观察记录和分析，加强理论与实践的联系，深化对理论知识的理解。根据相关理论和文献资料，我们设计了以诱导愈伤组织为主的开放式组织培养实验方案。

（一）外植体材料：月季花

本实验材料取自盆栽的月季，植物叶片和茎段均是诱导愈伤组织和进行细胞悬浮培养的理想材料，叶片诱导率稍高于茎段，能达到90%以上，茎段培养则最简便，成苗速度最快，且以茎段中芽为最好，接种后，中段芽第5 天左右就能萌发。为避免误差和便于得出结果，在选择外植体时最终确定选用带腋芽部分的茎段做外植体材料。

（二）主要试剂

MS 基础培养基、1mg /mL6-BA、0. 5mg /mL NAA、1mol /L NaOH溶液、市售大蒜素、市售多菌灵粉剂。

（三）实验方法

培养基配制：取2只2000mL规格的锥形瓶，分别标记大蒜素、多菌灵。分别称量MS 干粉培养基50g 放于锥形瓶中，加800mL 蒸馏水在电热炉上慢慢搅拌煮沸至溶液完全透明，然后加入蒸馏水将溶液定溶至1000mL。待溶液冷却至40℃ ～ 50℃ 时，分别在以上2 瓶中分别加入0.15g/mL大蒜素溶液10mL，稀释600倍的多菌灵溶液，然后加入6-BA 1mg /mL 2mL，NAA 0. 5mg /mL 0. 5mL，混匀后，调节pH 到6. 8，然后将培养基倒入组培瓶中拧紧，每瓶50mL，分别标记所加物质作为记号，水平放置至凝固。

消毒：剪取当年抽生侧芽饱满的幼嫩茎段，剪去顶部和基部并去叶，剪成2cm长带有侧芽的茎段，自来水冲洗10-20分钟；75%乙醇浸泡30秒，再用0.1%Hgcl2溶液灭菌5-10分钟，无菌水冲洗4-5次，获得无菌苗备用。

接种：从瓶中取出月季无菌苗剪取腋芽段插入培养基，以培养基平面不没过腋芽处为准，拧上盖子，放入光照培养箱中进行培养。在外植体的接种时采用了垂直接种，斜向上45度接种，采用这样的接种方式，腋芽再生芽数多，且生长健壮，这与植物的生长习性有一定关系。

培养条件：设置为一般植物组织培养的条件，温度控制在24℃左右，光照时间为12h/天，光照强度为1000～2000Lx，实验接种后先暗室培养一周，再在光照下培养。定期观察记录，随时取走出现严重污染的组培瓶。

二、结果与分析

经过20天观察， 两种培养方式均获诱导获得了愈伤组织，统计结果如下表。

通过对这两种抗菌物质的抗菌效果的比较，得出多菌灵在开放式组培中的抑菌效果较好，且两者的成活率都达到或超过了50%。这种开放式的方法降低了技术难度，可操作性更强，设备投入成本较低，对于建设植物组织培养实验有较大的可行性。出芽和生根的再分化实验过程，可参考相关资料，探究由愈伤组织诱导出芽及生根所需培养基和生长素的最佳浓度配比，调节植物激素的浓度继续实施。

在开放式组培实验中，不同的外植体选择何种抑菌剂及其浓度是非常关键的因素，需参考相关文献及各种生产实践进一步摸索。多菌灵是一种高效广谱内吸性杀菌剂，其通过抑制病原菌纺锤体的形成来影响细胞分裂，对多数半知菌和子囊菌具有抑制作用。大蒜提取物中主要成分是大蒜素，具有较强的抗菌消炎作用，对多种球菌、杆菌、真菌、病毒等均有抑制或杀灭作用，其在低浓度时能够抑制真菌生长，在高浓度时可完全杀死真菌，且大蒜素是生物农药，对植物生长影响较小，这两种抑菌剂的应用范围相对比较广泛。

以开展开放式组培条件探究实验为契机，培养学生探究实验，可以从无菌和抑菌等多种角度对植物组织培养进行探究，在高中学生中开展这方面的课题研究，不仅能锻炼学生多方面思考创新的能力，并且紧密结合生产实际，是实验课程改革思路的又一探索模式。

参考文献：

[1] 王晓煌，黄胜琴，李玲. 4种抑菌剂在烟草开放式组织培养中的应用[J].广东农业科学，2015， 42（5）：58-62.

[2] 王艳红，龚束芳，车代弟.丰花月季愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养[J].东北農业大学学报，2007，38（2）：161-165.