常见彩绘文物霉菌抑菌剂评价体系的构建

郭金沂,王丽琴,任宇华,彭镁漫,赵 星,吴 晨,郭 郎

[1. 西北大学文化遗产学院,陕西西安 710027; 2. 文化遗产研究与保护技术教育部重点实验室(西北大学),陕西西安 710027; 3. 西安市文物保护考古研究院,陕西西安 710068]

0 引 言

青霉、曲霉、枝孢菌和链格孢菌是彩绘文物常见的霉菌,其生长代谢会引起彩绘的变色、褪色及脱落等病害,对彩绘文物造成严重破坏[1-2],例如:日本高松冢曾为原址保护的国际典范,但因滋生霉菌使彩绘文物表面产生了难以去除的生物黑斑,从而被迫解体搬迁至异地保护[3-4];法国拉斯科洞穴岩画因表面彩绘产生腐生真菌使有机物分解,为藻类和其他微生物提供营养物,促进藻类生物膜的二次定植,增加了微生物的多样性,由此长期处于关闭状态[5];青霉、曲霉、枝孢菌和链格孢菌还广泛存在于罗马尼亚木质教堂绘画[6]、基辅圣索菲亚大教堂中世纪壁画[7]、西安韩休墓壁画[8]和古埃及壁画[9]等多处彩绘文物上。

防止霉菌生长的重要手段是使用抑菌剂。克霉唑[10]、异噻唑啉酮、苯扎氯铵[11]、链霉属抗生素[12]、双氯酚[13]、苯并咪唑类药物、戊唑醇[14]、罗勒[15]、丁香[16]、肉桂[17]和百里香精油[18-19]、纳米银[20-21]等常常作为文物抑菌剂使用,其中辛基异噻唑啉酮是控制真菌生长的最有效抑菌剂[22]。以往研究发现,不同菌种对特定抑菌剂的敏感性不同,抑菌剂的使用浓度也不尽相同,如苯扎氯铵和异噻唑啉酮是文物上最常使用的抑菌剂,但苯扎氯铵的实际使用浓度却往往高于异噻唑啉酮[23]。施加过量抑菌剂会造成环境污染,并使微生物过早产生抗药性。目前,在多种评价抑菌剂抑菌效果的方法中,抑菌圈是最常见的一种[13],还有最小抑菌浓度值(MIC)[14-15]、抑菌率[20]、毒力[24]、平板计数和ATP荧光法计算有效菌含量[13]等方法。使用上述方法评价抑菌剂抑菌效果各有优劣:MIC代表短时间内抑菌剂拥有抑菌活性的最小浓度,实际药剂使用浓度远远超过该值;抑菌率和毒力表征了抑菌剂在固定浓度时的抑菌效果,这两者都无法表征抑菌的长效性;有效菌落数检验能表征抑菌的长效性,但用时长、误差较大。综上:使用单一方法筛选抑菌剂,其评价指标不够全面和系统;使用两种或多种方法评价抑菌效果时,各方法的选择缺乏科学性和逻辑性。截至目前仍缺乏科学的评价彩绘文物抑菌剂的方法体系——面对复杂多样的霉菌,如何在众多的抑菌剂中选择出有效的抑菌剂,并采用适宜的浓度进行抑菌处理,成为利用抑菌剂防止文物霉变的瓶颈问题。因此,构建一套合理的抑菌剂评价体系具有重要意义。本研究以五种彩绘文物上常见霉菌和12种抑菌剂为研究对象,通过对抑菌剂活性、色度变化、抑菌效果及其长效性的评估,旨在构建一套彩绘文物抑菌剂综合性能的评价体系,为彩绘文物抑菌剂的合理选择提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 霉菌材料

选择产黄青霉、杂色曲霉、枝孢菌、交链孢霉和日本曲霉五种霉菌为研究对象,它们分别属于彩绘文物常见菌属——青霉属、曲霉属、枝孢菌属和链格孢菌属,其中前三种霉菌也是课题组在高湿环境下彩绘颜料中分离出的优势菌种[25],后两种霉菌是唐代彩绘陶器上分离的优势菌种。在麦芽浸膏琼脂培养基(MEA)中,五种霉菌均生长良好,形貌清晰。

1.2 抑菌剂材料

文物保护中使用抑菌剂可分为三类:人工有机抑菌剂、人工无机抑菌剂和生物抑菌材料。本研究选择如下:人工有机抑菌剂应用广泛、种类众多,化学成分各不相同,实验为了较为全面地评价抑菌剂,根据化学成分选择五类六种人工有机抑菌剂(异噻唑啉酮、戊唑醇、克霉唑、苯并咪唑、苯扎氯铵、双氯酚);一种人工无机抑菌剂(纳米银);两类五种生物抑菌材料(纳他霉素、肉桂精油、丁香精油、百里香精油和罗勒精油)。这12种抑菌剂的基本信息见表1。

表1 12种抑菌剂的基本信息Table 1 Basic information on 12 kinds of fungicides

1.3 测量方法

1.3.1抑菌剂活性测量方法 以最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)表征抑菌剂的活性,其测量方法如下:将液体麦芽浸膏培养液(每升水含30 g麦芽浸粉和3 g大豆蛋白胨)加入96孔板后,在其中继续加入以水为稀释溶剂的抑菌剂-无菌水混合液(部分抑菌剂溶解性差,实验前进行3 h超声波震荡使抑菌剂-水体系混匀)以2倍梯度稀释法连续稀释,混合均匀后在每个孔中加入等量霉菌孢子液。在30℃下培养2 d,肉眼观察真菌的生长状况,将培养液保持澄清的抑菌剂最低浓度定义为MIC。将96孔板中澄清培养液20 μL涂布于MEA上,30℃下培养3 d,培养基上未出现真菌生长的抑菌剂最低浓度定义为MBC,如果MBC≥32MIC,说明霉菌已经出现抗药性[26]。

1.3.2色度变化测量方法 选取朱砂、土红、群青、石绿和铅白五种颜料,加3%明胶水溶液研细后涂刷在载玻片上作为彩绘模拟样品,实验全程保持无菌。将抑菌剂施加于彩绘模拟样品表面,自然晾干后,重复三次操作。采用非接触式色度计测定抑菌剂施加前后样品的L*(亮度)、a*(红绿色品坐标)、b*(黄蓝色品坐标),根据式1计算色差值(ΔE),以ΔE表征颜色的变化,肉眼可见的颜色变化极值为ΔE=3.0。由于彩绘文物的色彩是其重要的外貌特征,施加抑菌剂后ΔE不宜超过3.0。

1.3.3抑菌效果评价方法 抑菌效果评价内容包括抑制霉菌孢子萌发效果和抑制霉菌菌丝体生长效果两个方面。

1) 抑制霉菌孢子萌发效果的评价方法。以半最大效应浓度(EC50)表征抑制霉菌孢子萌发效果。EC50是指在特定暴露时间后,能达到50%最大生物效应对应的药物、抗体或者毒素等的浓度。本实验中,EC50代表抑制一半孢子萌发所需的抑菌剂浓度。其测量方法如下:将培养好的霉菌孢子用去离子水从MEA上洗脱、过滤、两次离心(1 000 r/min)5 min后用去离子水将孢子重悬浮,以0.5%葡萄糖无菌水溶液调节孢子浓度至6×106个/mL(A液)。根据选择的质量分数梯度对抑菌剂进行稀释:水溶性抑菌剂直接用水溶解稀释;难溶于水的抑菌剂用乙醇溶解后用0.1%吐温80水溶液稀释,确保最终乙醇体积分数<2%。

将0.5 mL A液和0.5 mL抑菌剂溶液混匀后滴到凹玻片上,放于带有浅层水的培养皿中加盖保湿培养,并设不加抑菌剂组作空白对照。在30℃下培养2 d,当空白对照孢子萌发率(R0)达到95%以上时,观察孢子萌发状况,保证观察孢子总数为200～300。根据式2～式4计算孢子萌发率(R)、校正孢子萌发率(Re)和孢子萌发相对抑制率(I)。采用SPSS软件建立I值与抑菌剂质量浓度间的毒力回归方程,由此计算出当I值为50%时,抑菌剂的质量浓度,即EC50。

(2)

(3)

(4)

式中:Ng为孢子萌发数;Nt为调查孢子总数。

2) 抑制霉菌菌丝体生长效果的评价方法。利用抑菌圈法表征抑菌剂抑制霉菌菌丝体生长效果以评价抑菌剂的敏感性。通常抑菌圈直径越大,药剂敏感性越强,其抑制霉菌菌丝体生长的效果越好。测量方法如下:将直径6 mm、厚1 mm的滤纸在抑菌剂中浸泡1 h后取出自然晾干12 h,置于涂布有50 μL 106个/mL待测霉菌孢子的MEA培养基上30℃培养4 d,用游标卡尺测量抑制圈直径。

1.3.4长效性评估方法 以可培养真菌浓度表征抑菌剂在彩绘颜料上抑菌的长效性,参考文献[13]的方法进行测量:于施加抑菌剂后的90 d时,用无菌解剖刀对杀灭实验区及未做处理的霉变对照区内彩绘模拟样品表层采样,置于无菌水中混匀后,涂布于MEA培养基上,30℃下培养4 d后计算可培养真菌浓度C(CFU/g)并进行差异性ANOVA分析,式5为计算公式。

(5)

式中:T表示平板上有效菌落数(CFU);A表示稀释质量浓度(g/mL);B表示涂布平板时的用量(mL)。

2 结果和讨论

2.1 抑菌剂活性与耐药性判别

以MIC和MBC值表征抑菌剂的活性,其数值越小,抑菌剂活性越高。表2为12种抑菌剂对五种霉菌的MIC和MBC值,由该表可以看出:

表2 12种抑菌剂对五种霉菌的MIC和MBCTable 2 MIC and MBC of 12 kinds of fungicides on five molds (mg/L)

1) 同一种抑菌剂对五种霉菌的抑菌活性存在差异。以肉桂精油为例,对杂色曲霉的MIC为125 mg/L,而对日本曲霉的MIC为500 mg/L。

2) 对同一种霉菌,不同抑菌剂的MIC和MBC数值可能极其相近,也可能相差较大,但MIC≤MBC。以日本曲霉为例,戊唑醇的MIC和MBC均为31.25 mg/L,而肉桂精油的MIC和MBC分别为500 mg/L和1 000 mg/L。本研究的12种抑菌剂对五种霉菌未出现抗药性(MBC<32MIC)。如果出现霉菌对特定种类药剂产生抗药性,建议放弃此种药剂,更换其他抑菌剂;否则,不但抑菌效果差,还会因药剂滥用污染环境。

3) 异噻唑啉酮、戊唑醇和纳他霉素在31.25～250 mg/L范围,对五种霉菌有抑菌活性;克霉唑、苯扎氯铵、双氯酚、肉桂精油和丁香精油在125～2 000 mg/L范围,对五种霉菌有抑菌活性;百里香精油、罗勒精油、苯并咪唑和纳米银>1000～8 000 mg/L才出现良好的抑菌活性。因此,通过MIC和MBC值可获取抑菌剂活性及其耐药性信息,为抑菌剂种类及其浓度的合理选择提供科学依据。本实验舍弃抑菌活性较差的百里香精油、罗勒精油、苯并咪唑和纳米银,选择其余八种抑菌剂继续进行后续实验。

在彩绘文物保护中,常使用质量分数表示药剂浓度,MIC和MBC的传统单位为mg/L,两者转换关系如下:体积分数75%的酒精溶液作为溶剂时,250 mg/L约为0.029 6%,其余以此类推。根据以上八种抑菌剂的MIC和MBC值,设置5组质量分数梯度C1～C5。设置浓度梯度的原则是:C1处于最小MIC和最大MBC之间;C2略大于最大MBC;C3、C4和C5分别为2倍、3倍和4倍的C2。综上,异噻唑啉酮、戊唑醇、纳他霉素的质量分数为C1:0.01%、C2:0.05%、C3:0.1%、C4:0.15%和C5:0.2%。克霉唑、苯扎氯铵、双氯酚、肉桂精油和丁香精油的质量分数为C1:0.1%、C2:0.5%、C3:1%、C4:1.5%和C5:2%。

2.2 颜色变化

由图1可知,施加0.2%(C5)纳他霉素能引起群青、铅白和朱砂颜色的明显变化(ΔE>3.0),不宜使用。

图1 抑菌剂(C5)对彩绘颜色的影响Fig.1 Effects of the fungicides at C5 concentration on pigment colors

2.3 抑菌效果评估

2.3.1孢子萌发的抑制效果 EC50值越小,药剂的毒性越强、对孢子萌发的抑制效果越好。经计算处理,求出孢子萌发相对抑制率Y(%)与抑菌剂质量浓度X(mg/L)间的毒力回归方程和EC50,结果见表3,从中可以看出:

表3 七种抑菌剂对五种霉菌的毒力测定Table 3 Toxicities of seven kinds of fungicides on five molds

1) 对于枝孢菌和日本曲霉,戊唑醇的EC50最小、药剂毒性最强、对孢子萌发的抑制效果最好;对于产黄青霉、杂色曲霉和交链孢霉,异噻唑啉酮对孢子萌发的抑制效果最好。对于五种霉菌:丁香精油的EC50>10 000 mg/L或无法测出,其毒性弱、抑菌效果差,不宜使用;双氯酚的EC50值也相对较高,抑菌效果较差。

2) 药剂毒力与其抑菌活性密切相关。一般说来,抑菌剂毒性越强,产生抑菌活性所需药剂的浓度越低,但两者不是线性关系,例如:双氯酚、苯扎氯铵对枝孢霉和杂色曲霉的抑菌活性(MIC和MBC)在同一区间(表2),但双氯酚对这两种菌的EC50是苯扎氯铵的两倍。同样,对日本曲霉,肉桂精油与双氯酚的抑菌活性相同,但双氯酚的EC50约是肉桂的四倍。在文物保护中,尤其是露天文物,往往受限于原位环境,环境中的霉菌孢子数量众多,因此抑菌更倾向于在孢子萌发阶段进行,即推荐选择EC50小的抑菌剂。

3) 在复杂的彩绘文物保护中,可能多种优势霉菌共存,应根据优势菌种的实际情况,有针对性地选择两种或者两种以上抑菌剂混合使用。判断抑菌剂混合使用是起到促进作用还是拮抗作用,SR(协同比)具有重要参考价值[27]。SR为混剂的理论EC50[EC50(th),mg/L,式6]与混剂的实测EC50[EC50(AB),mg/L]的比值(如式7所示)。

(6)

(7)

式中:A、B分别代表两种抑菌剂;a和b分别代表混剂中A、B的质量分数;EC50(A)和EC50(B)分别代表A和B的EC50(mg/L)。

依据混剂的SR值,可合理选择混剂中各抑菌剂的种类及其配比。一般认为:当SR值<0.5时,两种药物之间存在拮抗作用;SR值>1.5时,两种药物具有协同交互作用。

2.3.2霉菌生长的抑制效果 抑菌圈是判定抑菌剂敏感性的重要指标:当抑菌圈直径≥20 mm,抑菌剂对该霉菌的抑菌性到达高敏;10～20 mm时为中敏;7～10 mm时为钝敏;<7 mm时不敏感。一般抑菌圈直径达到18～22 mm,即中敏到高敏之间时,认为抑菌效果良好。抑菌圈实验结果见图2,从中可知:

图2 六种抑菌剂对五种霉菌的抑菌圈Fig.2 Inhibition zones of six kinds of fungicides on five molds

1) 六种抑菌剂的抑制圈直径通常随着抑菌剂浓度的增加而变大。

2) 在95%置信区间内,0.15%异噻唑啉酮和2%苯扎氯铵对五种霉菌都达到了高敏,0.15%戊唑醇、2%肉桂精油和克霉唑对部分霉菌虽然无法达到高敏,但抑菌圈直径区间处于18～22 mm,抑菌效果良好;然而,苯扎氯铵、肉桂精油和克霉唑的适宜浓度是异噻唑啉酮、戊唑醇的十余倍;双氯酚在测试浓度范围内无法使任何一种霉菌的抑制效果达到高敏,抑菌效果最差,不宜使用。

3) 部分抑菌剂当其浓度达到一定值后,抑菌圈直径随浓度增加缓慢增大,甚至可能出现小幅度减小,例如:对产黄青霉,0.15%和0.2%质量分数的戊唑醇其抑菌圈直径差距很小;而2%双氯酚的抑菌圈直径略小于1.5%。说明在达到一定浓度后,继续提高浓度对抑菌效果的提升作用影响甚微,甚至会出现负作用。因此,如果使用这些抑菌剂,应将浓度控制在合理的范围,杜绝因药剂使用浓度过大造成滥用。

2.4 抑制效果的长效性

根据文物保护原则,理想的抑菌剂在彩绘文物上应能长期起到良好的抑菌作用,而2.1、2.3部分是从药理学角度出发,测试短时间内抑菌剂的抑菌效果,这些指标的测试与评估对于抑菌剂的筛选是十分必要的,但短期抑菌效果好的药剂未必能够长期有效。因此,评估抑菌剂抑菌效果的长期保持性是非常重要的,为此引入抑制效果的长效性指标,通过测量施加抑菌剂杀灭霉菌一段时间后霉菌重新生长量的浓度来表征。

表4为彩绘模拟样品在施加抑菌剂90 d后测得的可培养微生物浓度,可培养微生物浓度越大抑菌效果越差。表中数据进行同列比较,数据后有相同字母者表示差异不显著(P>0.05),数据由大到小标注为a、b、c等。由表4可知:

表4 施加抑菌剂90 d后可培养微生物浓度Table 4 Concentrations of cultivable fungi after 90 days of fungicide application (103 CFU/g)

1) 任意彩绘颜料上的任意一种霉菌,空白对照组的可培养微生物浓度均大于五个施药组,如在群青颜料上产黄青霉的空白对照组为838 000 CFU/g,是施药组最大值(戊唑醇)的20倍。且根据差异性分析做abc分类标注,所有空白对照组均为a,与施药组差异性显著,因此所有抑菌剂对五种霉菌在测试时间90 d内均有明显抑菌效果。

2) 不同抑菌剂抑菌效果的长效性存在差异,这种差异不仅与抑菌剂有关,还与霉菌种类有关。对于产黄青霉、杂色曲霉、枝孢菌和交链孢霉,多数颜料上abc标记法能分出a、b和c这三个字母,笔者认为每种颜料条件的标注均含b时,抑菌剂抑菌效果长效性较差。对于产黄青霉,戊唑醇和肉桂精油的差异性均包含b,长效性较差;同理对于杂色曲霉,异噻唑啉酮和克霉唑较差;对于枝孢菌,克霉唑和苯扎氯铵较差;对于交链孢霉,肉桂精油、克霉唑较差。

对于日本曲霉,疏松的结构导致其在施药后极易从彩绘上分离,因此对于群青、朱砂和土红这三种日本曲霉能旺盛生长的颜料条件下,空白组和施药组差距非常大,而各施药组间的差异性远不如其与对照组的差距。以土红为例,施药组最大值与空白对照组差距超过了26倍,而施药组最大值与最小值的差距仅为五倍,这导致差异性分析中的分组过少,因此对日本曲霉的抑菌长效性,以各施药组的可培养浓度具体数值结合石绿颜料上的显著性标记进行分析。石绿上日本曲霉生长受到明显的抑制,空白对照组的可培养微生物浓度仅为11 200 CFU/g,这说明能生长出来的日本曲霉经过了选择,具有一定的毒性抵抗能力,因此,石绿上施药组和空白对照组的差距远小于其他颜料,这使差异性分析中字母标注的变多,出现了d和e字母。综合四种颜料的可培养微生物浓度和字母分类,笔者认为石绿颜料上包含b和c的异噻唑啉酮和肉桂精油长效性较差。总体而言,苯扎氯铵对多数霉菌的抑菌效果长效性相对较好。

3) 霉菌在不同彩绘颜料上的生长存在差异性。在群青上,五种霉菌都能良好生长,几种抑菌剂抑菌效果的长效性皆不佳。在朱砂、土红和石绿上,五种霉菌都能生长,但有效菌落数均小于群青,尤其是日本曲霉在石绿上生长受到严重抑制。在铅白上,日本曲霉无法生长,空白对照组和施药组可培养微生物浓度均为0 CFU/g;其他四种霉菌生长受限,其有效菌落数小于其他四种颜料。铅白抑制霉菌生长的机制与彩绘颜料的金属离子毒性密切相关[24]。

综上,本研究表明0.15%异噻唑啉酮和戊唑醇,2%苯扎氯铵、肉桂精油和克霉唑对常见霉菌敏感性强、抑菌效果良好。结合文献可知,筛选出的抑菌剂适宜浓度接近或小于实际文物保护浓度,例如:武发思等[13]研究表明0.2%霉敌(主要成分为异噻唑啉酮)对徐显秀墓霉菌杀灭的中长期效果最好;5%Preventol R-80(主要成分为苯扎氯铵)对枝孢菌的抑菌圈>30 mm[12];韩休墓使用3%克霉唑乙醇溶液进行全墓室的喷洒,其抑菌效果良好[8]。说明该评价方法体系具有一定的科学性。

2.5 抑菌剂性能评价的程序与方法体系的初步构建

按照以下程序与方法进行抑菌剂性能评价,初步构建常见彩绘文物霉菌抑菌剂的评价体系。

1) 通过测量抑菌剂的MIC和MBC值以确定其活性,其值越小,抑菌活性越高;同时,根据MBC≥32MIC判别药剂产生抗药性。由此获取抑菌剂活性及其耐药性信息,初步确定抑菌剂种类及其浓度梯度。

2) 通过测定施加抑菌剂前后彩绘颜料表面的色差值ΔE以获取颜色变化信息,ΔE>3.0作为颜色改变的依据。

3) 基于对霉菌孢子萌发效果抑制和霉菌菌丝体生长效果抑制两个方面来评价抑菌剂的抑菌效果,分别以EC50和抑菌圈大小表征:EC50越小,对孢子萌发的抑制效果越好;抑菌圈直径越大,对霉菌菌丝体生长抑制效果越好。

4) 通过测量在彩绘模拟样品上(对实际文物,彩绘模拟样品为原位环境下的文物彩绘)培养一段时间后培养基上的有效活菌落数,换算得到可培养真菌浓度,以此表征抑菌剂在彩绘颜料上抑菌的长效性。可培养真菌浓度越低,抑菌剂抑菌效果长效性越好。

在初步构建的抑菌剂评价方法体系中,前三点主要确定了单一霉菌的抑菌剂抑菌效果和浓度,是实验室初步筛选。在特定遗址中,面临的优势霉菌具有特异性,受环境因素影响可能与本实验涉及的五种霉菌不完全相同。因此,在彩绘文物保护的实际中,要先确认彩绘表面的是单一还是多种优势霉菌,存在多种优势霉菌时在第三点筛选结束后,可以根据各种霉菌的丰度,有针对性选择多种抑菌剂进行混剂的SR值测定,选择后续进行长效性实验的组合抑菌剂配方。第四点长效性实验是对于遗址原位筛选的试验及评价,是抑菌剂性能评价中最为重要的一环,本研究的长效性实验对象是模拟彩绘样品,环境较为稳定,彩绘基体内部无菌丝入侵,90 d后菌落数量就不再明显变化。但原位环境中,抑菌剂的长效性与优势菌株丰度和使用环境中微生物群落变迁有很大关系,每一处遗址面临的微生物病害可能都不同,推荐延长第四点的长效性实验时间,能更客观准确地评价抑菌剂。

3 结 论

1) 本研究初步构建了彩绘文物抑菌剂评价程序与方法体系:通过测量抑菌剂的MIC和MBC值对其进行初步筛选并判断霉菌是否对抑菌剂产生抗药性;依据色差值ΔE判断抑菌剂是否会改变彩绘文物的颜色;测定抑菌剂的EC50和抑菌圈大小评估抑菌剂抑菌效果;通过彩绘模拟实验计算可培养真菌浓度从而监测抑菌效果的长效性。在此基础上进行综合评价。

2) 本研究发现:0.15%异噻唑啉酮和戊唑醇,2%苯扎氯铵、肉桂精油和克霉唑对常见霉菌敏感性强、抑菌效果良好;同时,苯扎氯铵对五种霉菌抑菌效果的长效性良好;0.2%纳他霉素会引起部分颜料的颜色发生明显变化。在实际彩绘文物保护中,面对多种优势霉菌,可筛选并使用具有良好协同作用的混合抑菌剂。