粉尘颗粒诱导大鼠肺泡巨噬细胞培养条件的优化

张智燕，王彩虹

1.内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院检验科，内蒙古包头 014010；2.包头市第三医院内科，内蒙古包头 014010

粉尘颗粒诱导大鼠肺泡巨噬细胞培养条件的优化

张智燕1，王彩虹2

1.内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院检验科，内蒙古包头 014010；2.包头市第三医院内科，内蒙古包头 014010

目的利用极差分析法和正交实验探究外周血分离白细胞的最佳条件。方法利用不同的转速、时间分别分离外周血液中的白细胞，将所得的细胞重悬液转移到培养皿中，在荧光倒置显微镜下计数细胞个数，再采用正交实验和极差分析法对实验数据进行分析。结果通过极差分析法发现，血量的极差最大，时间的极差最小，所以对分离白细胞最主要的影响因子为血量，最小的K值反映了最适宜的配比，该配比离心转速为1 000 rpm、时间为20 min、血量为5 mL。结论外周血分离白细胞的最佳条件为离心转速1 000 rpm、时间20 min、血量5 mL。

白细胞；尘肺；Fas基因；可变剪接

尘肺是工人工作过程中经常吸进大量的生产性粉尘，并且在肺内长时间滞留而引起的一种全身性疾病[1]，主要是以肺组织纤维化为主。而尘肺病中矽肺发病率高并且严重[2]。矽肺是因为长久吸进大量 SiO2导致肺组织发生纤维化的一种疾病。它是尘肺病当中最普遍的一种疾病。很多职业的日常活动中都会产生大量灰尘，而且接尘工人遍及各地，所以发病率特别高。现今，人们已了解到矽肺的危害是其致纤维化作用，并对矽肺进行了深入研究，研究还发现接尘工人的肺癌也是高发，肺癌也是矽肺病的主要死因之一[3]。

目前尘肺的发病机制尚未清楚，而公认的学说有矽尘致纤维化学说，脂质过氧化应激学说，免疫学说的观点，细胞凋亡学说，细胞因子学说等来阐述它的病因[4-5]。国内外研究显示尘肺患者体内细胞凋亡和坏死密切相关的Fas基因发生了可变剪接。为了更好地研究Fas基因发生可变剪接在尘肺发生发展中的作用，特对粉尘颗粒诱导大鼠肺泡巨噬细胞培养条件进行了优化。

1 实验材料、试剂、仪器

材料：来自包头医学院第一附属医院当天体检患者的抗凝（EDTA-K2）全血，要求无传染病，无溶血。

主要试剂、仪器，见表1。

表1 主要试剂、仪器

2 实验方法

2.1 分离外周血液中的白细胞

实验步骤：①取一支15 mL离心管，加3 mL淋巴细胞分离液；②用移液枪小心吸取血液样本加于分离液之液面上，4℃，500 rpm，30 min离心，为分离白细胞得到最佳的效果进分离条件优化，条件如下：4℃、590 rpm、30 min；4℃，450 rpm、30 min； 4℃、500 rpm、30 min； 4℃、700rpm、30min；4℃、 800rpm、30min；4℃、 900rpm、30 min；4℃、1 100 rpm、30 min；③离心后，此时离心管中溶液由上往下分为3层，上层是血浆，中间层是乳白色淋巴细胞层，底层是红细胞层；④用移液枪小心吸取第2层环状乳白色淋巴细胞到新的15 mL离心管中，再加入10 mL清洗液（型号2010×1118）混匀清洗细胞；⑤4℃、250 rpm，离心10 min；⑥弃上清；⑦加入5 mL的清洗液（型号2 010×1 118）重悬所得细胞；⑧4℃、250 rpm，离心 10 min；⑨重复6，7，8后弃掉上清液，以0.5 mL含10%血浆完全培养液重悬细胞；⑩把细胞液转移到60 mL一次性培养皿中，在荧光倒置显微镜下用血球计数板计数细胞个数。

2.2 正交试验

分离白细胞最佳工艺的确定是采用正交实验法，正交实验设计是安排多因子的一种常用方法，通过合理的实验设计，可用少量的具有代表性的试验来代替全面试验，较快地取得实验结果。经过之前的探究实验影响分离白细胞效果的主要因子是转速、时间、血量，共3个因子，转速和时间分别为离心的条件。每个因子取3个水平。所以本实验的正交实验进行如下设计：由于是三因子、三水平，所以选用L9(34)，将转速、时间、血量分别安排在第1、2、3列，共安排9个试验点。 见表2、表3。

2.3 正交实验数据处理

K1(1)=(12＋4＋9.6)/3×107=8.5×107

K1(2)=(12＋2＋1.2)/3×107=5.06×107

K2(1)=(2＋26＋9.2)/3×107=12.4×107

K2(2)=(4＋26＋3.2)/3×107=11.07×107

K3(1)=(1.2＋3.2＋4)/3×107=1.6×107

K3(2)=(9.6＋9.2＋4)/3×107=6.4×107

K1(3)=(1.2＋3.2＋4)/3×107=15.7×107

K2(3)=(2＋4＋4)/3×107=2.1×107

K3(3)=(1.2＋26＋9.2)/3×107=2.1×107

表2 因子水平表

表3 实验安排及结果

极差分析法：首先分析因子1(转速)，把因子1取1水平(800 rpm)的3次实验(1,4,7号)的实验结果取平均值：K1(1)=(12＋4＋9.6)/3×107=8.5×107同理计算其他因子在一定水平的平均值。极差计算：极差=最大均值—最小均值R=K2(1)-K3(1)=(12.4-1.6)×107=10.8×107其他的极差计算以此类推。经计算结果依次为6×107与13.6×107。

3 实验结果与分析

3.1 分离外周血液中白细胞正交实验的结果与分析

通过上述可知，初步探索从人外周血液中分离白细胞最佳离心条件为转速1 000 rpm，时间20 min，血量5 mL。见图1。

图1 离心后血液的分层现象

3.2 分离白细胞最佳的条件结果分析

该实验外周血分离白细胞的最佳条件确定采用正交实验方法。见表4。

表4 9个试验点的K值及极差

采用极差分析法实验结果及分析：①通过比较各因子极差的大小。极差越大，说明该因子的水平变动时，实验结果的变动越大，即该因子对实验结果的影响越大，从而可以按极差的大小来决定因子的主次顺序。该实验为：血量＞转数＞时间。所以对分离白细胞最主要影响因子为血量。②确定较适宜的配比。K1、K2、K3反映了因子各水平对实验结果的影响，因而最小的K值对应了最好的水平，对该实验较适宜的配比为：离心转速为1 000 rpm，时间为20 min，血量为5 mL。

4 实验结论

采用正交实验法初步确定了最佳的分离条件，离心转速为1 000 rpm，时间为20 min，血量为5 mL。影响最大因子为血量，其次是转速，最后为时间。

中国是受粉尘颗粒影响最严重，污染最大的国家之一，尘肺患者数中无论是新发，还是现患尘肺患者数均居全世界之首[6]。国家卫生计生委疾病预防控制局在有关职业病预防治疗工作情况的调查显示尘肺病发病例报告的病例数占2012年全国职业病总例数的88.28%。

并且尘肺病发病率持续升高，而且患病患者出现工龄递减趋势，截止到 2016年，患有尘肺病的总人数已超 72万例。

有学者在研究RNA序列是否能够编码多个蛋白质过程中，提出并运用了可变剪接概念进行解释里面出现的现象。在前面很多对基因的科学研究中表明高等真核生物的基因序列存在可变剪接[7-8]，数量大约为5%。可见，pre-mRNA的可变剪接在产生受体多样性及生物生长发育中有着重要的决定性作用[9]，同时也是控制基因表达和产生蛋白质多样性的重要机制。许多疾病的发生都与可变剪接有关。

[1]郑木林,胡天桥.我国尘肺病流行现状与控制对策[J].职业与健康,2010（17）:1932-1934.

[2]蒲新明，白鸥.尘肺病防治的研究概况[J].中国煤炭工业医学杂志,2009,12(6):1464-1466.

[3]李宏鹏，李忠贵.矽肺合并肺癌的CT分析[J].内蒙古中医药,2012（182）:89-90.

[4]陈敏,王世鑫.矽肺发病机制的研究现状[J].武警医学院报,2005（14）:492-494.

[5]丰培金，卢强，李莲瑞，等.鲤鱼外周血白细胞的分离和体外培养[J].中国兽医学报,2004（4）:369-371.

[6]董会台,杨丽莉,赵秀国.石家庄粉尘作业危害及尘肺病现状的调查报告[J].职业与健康,2005（7）:995-996.

[7]Sharp PA.Split genes and RNA splicing[J].Cell,1994,77(6):805-815.

[8]许先国,吴俊杰,洪小珍,等.鉴定9个新的RHD基因mRNA可变剪接体[J].遗传,2006（10）:1213-1218.

[9]Grabowski PJ,Black DL.Alternative RNA splicing in the nervous system[J].Progress in neurobiology,2001（65）:289-308.

R446.1

A

1672-5654（2017）10（b）-0047-03

10.16659/j.cnki.1672-5654.2017.29.047

张智燕（1982-），女，内蒙古包头人，硕士，主管技师，主要从事临床检验工作。

2017-07-18）