THEM4与高糖诱导的人胚肾上皮细胞胶原分泌的关系

陈 宁 ，杨永辉，安晓颖，朱桂云，康丽菲，郝 军

(1.河北省胸科医院病理科，河北 石家庄 050041；2.河北医科大学基础医学院病理学教研室，河北 石家庄 050017)

·论著·

THEM4与高糖诱导的人胚肾上皮细胞胶原分泌的关系

陈 宁1，杨永辉1，安晓颖1，朱桂云1，康丽菲1，郝 军2*

(1.河北省胸科医院病理科，河北 石家庄 050041；2.河北医科大学基础医学院病理学教研室，河北 石家庄 050017)

目的探讨硫酯酶超家族成员4(thioesterase superfamily member 4,THEM4)在高糖刺激的人胚肾上皮细胞(human embryo kidney epithelial cells,HKC)内的表达以及与胶原分泌的关系。方法体外培养HKC，分别给予高糖(30 mmol/L)刺激0、6、12、24和48 h后，收集细胞。提取RNA， Real-time PCR检测THEM4 mRNA的表达；提取总蛋白，Western blot检测THEM4、phospho-Akt(Ser 473)、转化生长因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)、平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表达；免疫细胞荧光检测THEM4蛋白表达和定位；ELISA方法检测细胞上清液中Ⅰ型胶原(collagenⅠ,ColⅠ)、Ⅲ型胶原(collagen Ⅲ,Col Ⅲ)分泌情况。结果① 高糖培养HKC内THEM4表达明显降低，伴随phospho-Akt(Ser 473)、 TGF-β1和α-SMA表达上调；THEM4与TGF-β1和α-SMA表达呈负相关(分别为：y=-5.100 9x+1.178，R2=0.971 1;y=-3.803 3x+1.408,R2=0.893 9)。 ②高糖可刺激HKC分泌ColⅠ、Col Ⅲ。结论高糖诱导的HKC胶原的分泌可能是通过抑制THEM4表达，上调phospho-Akt(Ser 473)、TGF-β1和α-SMA蛋白表达而实现的。

肾小管；上皮细胞；胶原分泌；硫酸酶超家族成员4

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.12.018

硫酯酶超家族成员4(thioesterase superfamily Member 4,THEM4)，又称C末端调节蛋白，是Akt 的一种内源性抑制因子[1]，能结合Akt并抑制Akt磷酸化而阻断下游信号的传递，通过负性调控PI3K/Akt信号通路具有一定的抗炎及抗肿瘤效应[2-3]。目前THEM4主要集中于基因学方面的研究[4-5]，被认为是一种与心血管疾病、慢性肾脏疾病以及糖尿病等代谢性疾病发生相关的基因[6]，位于1号染色体长臂21～24区，通过调节体内糖平衡状态能够增加2型糖尿病的易感性[7]。笔者前期研究揭示PI3K/Akt信号通路与糖尿病肾小管上皮细胞细胞外基质(extracellular matrix,ECM)分泌和纤维化相关，是糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)发生发展的关键调控通路[8]。然而THEM4作为Akt的负向调控因子，是否参与了上述病理进程以及在高糖诱导的人胚肾上皮细胞(human embryo kidney epithelial cells,HKC)内的表达如何目前却尚不清楚。因此，本研究应用高糖培养HKC，观察高糖刺激下各个时间点HKC内THEM4、phospho-Akt(Ser 473)、转化生长因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)、以及平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表达情况，并同时检测细胞上清液中胶原的分泌，探讨THEM4与高糖诱导的HKC胶原分泌的关系，旨在为糖尿病肾脏ECM沉积的防治寻求理论依据。

1 资 料 与 方 法

1.1试剂及仪器 PrimeScript RT试剂盒(#RR047A)购自TaKaRa公司； TRITC-羊抗兔IgG、兔抗THEM4单克隆抗体(14692-1-AP)、兔抗β-actin单克隆抗体(20536-1-AP)、兔抗α-SMA单克隆抗体(14295-1-AP)均购自美国Protein Tech公司；兔抗phospho-Akt(Ser 473)单克隆抗体(#4060)、兔抗Akt单克隆抗体(#4685)均购自美国Cell Signaling公司；兔抗TGF-β1单克隆抗体(#AP12348a) 购自ABGENT；人CollagenⅠELISA试剂盒、人Collagen Ⅲ ELISA试剂盒均购自BlueGene Biotech。Real-time PCR仪购自安捷伦科技有限公司。

1.2方法

1.2.1HKC的培养及实验分组 HKC为本实验室冻存，用含10%胎牛血清及100 kU/L青霉素、100 mg/L链霉素的DMEM培养基培养，培养条件为37 ℃，5% CO2。将消化好的细胞接种于25 mL培养瓶中，细胞贴壁24 h后，经同步化后给予高糖(30 mmol/L)刺激0、6、12、24和48 h，终止培养并进行相关检测。

1.2.2Real-time PCR检测THEM4 mRNA的表达 采用Trizol法提取细胞总RNA，cDNA合成和目的基因扩增严格按照PrimeScript RT试剂盒(TakaRa,#RR047A)说明书操作，目的基因的引物分别为：THEM4 sense 5′-CCAGGAGCAGCTA-GGAGGTTA-3′antisense 5′-GTCTGAGGTCCTT-AGTCCAGC-3′，扩增片段91 bp；GAPDH sense 5′-TATCGGACGCCTGGTTAC-3′antisense 5′-CTGTGCCGTTGAACTTGC-3′，扩增产物140 bp，扩增条件为预变性95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，扩增40个循环。以GAPDH作为内参照校正，用2-△△Ct法分析基因的相对表达。

1.2.3Western blot检测蛋白表达 收集各组细胞并加入冰冷的裂解液(50 mmol/L Tris-Cl pH7.4、150 mmol NaCl、0.1%SDS、1%Triton-X 100、1 mmol/L EDTA、aprotinin 2 mg/L、PMSF 100 mg/L)200 μL提取总蛋白。采用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，分装后-80 ℃保存。每个样品取50 μg总蛋白，经10% SDS-PAGE凝胶电泳后电转移至PVDF膜；5%BSA 37 ℃封闭1 h，一抗[THEM4,Akt，phospho-Akt(Ser 473)]，α-SMA,TGF-β1及 β-actin，1∶1 000稀释)，4 ℃过夜。TBST洗膜后加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(1∶5 000稀释)，室温孵育2 h；TBST洗膜，滴加ECL增强化学发光试剂，Odyssey FC成像系统显影。用美国UVP公司LabWorks 4.5软件对条带进行定量分析，读取积分光密度值(integrated optical density,IOD)，目的蛋白条带的IOD值除以内参条带的IOD值作为最终结果进行统计分析。

1.2.4免疫荧光细胞化学检测 采用6孔板细胞爬片，高糖刺激24 h后终止培养，细胞用0.01 mol/L PBS冲洗数次，4%多聚甲醛固定30 min；0.5% Triton X-100 37 ℃打孔10 min，PBS冲洗，5 min×3次；正常山羊血清封闭，37 ℃孵育1 h；弃封闭液，滴加一抗(THEM4 1∶50)，4 ℃过夜；PBS冲洗，5 min×3次；滴加TRITC-羊抗兔IgG，37 ℃孵育1 h；PBS冲洗，5 min×3次；滴加 DAPI(1∶100配制)，37 ℃孵育10 min；PBS冲洗，5 min×3次；荧光显微镜下观察并摄取图像。

1.2.5ELISA检测细胞上清液中ColⅠ、Col Ⅲ的含量 先后加入稀释后的标准品50 μL、待测样品50 μL于反应孔内，立即加入50μL生物素标记的一抗，轻轻振荡混匀，37 ℃孵育45 min。甩去孔内液体，振荡洗涤4次，每次30 s。每孔加入100 μL辣根酶标记的二抗，轻轻振荡混匀，37 ℃孵育30 min。甩去孔内液体，振荡洗涤4次，每次30 s。每孔加入底物A、B各50 μL，轻轻振荡混匀，37 ℃孵育5 min，避免光照。取出酶标板，迅速加入50 μL终止液，立即测定结果。在450 nm波长处测定各孔的OD值。结果判定：以标准品的OD值为纵坐标，相应标准品浓度为横坐标，做标准曲线，样品含量根据其OD值由标准曲线换算出相应浓度。

1.3统计学方法 应用SPSS 13.0统计软件分析数据，计量资料比较分别采用F检验和SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1高糖诱导下HKC内THEM4 mRNA及蛋白表达 THEM4 mRNA及蛋白在0 h均可见一定量基础表达，随着高糖刺激时间的延长而显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。免疫荧光染色显示THEM4主要表达并定位于0 h组HKC的胞质，而高糖刺激24 h时表达明显减弱。见表1，图1。

2.2高糖诱导下HKC内phospho-Akt(Ser 473)、 Akt蛋白表达 phospho-Akt(Ser 473)蛋白在高糖刺激0 h时表达较弱，随着高糖刺激时间的延长而逐渐升高，并于高糖刺激后24 h达到高峰(P<0.05)，而总Akt蛋白表达在各组之间差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

组别THEM4mRNATHEM4蛋白0h1.000±0.0000.216±0.0216h0.282±0.173*0.205±0.00612h0.243±0.058*0.124±0.017*24h0.182±0.066*0.070±0.012*48h0.179±0.038*0.083±0.014*F63.32962.251P0.0000.000

*P<0.05与0 h比较(SNK-q检验)

图1免疫荧光染色检测高糖刺激0h(A)及24h(B)时HKC内THEM4蛋白表达

Figure1ImmunofluorescencestainingforTHEM4protein(indicatedinred)withDAPIcounterstaininginhighglucose-treatedHKCat0h(A)and24h(B)

组别phospho-Akt(Ser473)Akt0h0.063±0.0020.908±0.0556h0.074±0.0020.869±0.08612h0.182±0.001*#0.887±0.07324h0.686±0.002*#△0.901±0.06848h0.619±0.048*#△☆0.896±0.030F605.8460.160P0.0000.954

*P<0.05与0 h比较 #P<0.05与6 h比较 △P<0.05与12 h比较 ☆P<0.05 与24 h比较(SNK-q检验)

2.3高糖诱导下HKC内TGF-β1、α-SMA蛋白表达 Western blot结果显示，TGF-β1及α-SMA蛋白在高糖刺激 0 h时均有极少量表达，随着高糖刺激呈升高趋势，并于24 h时表达较高；定量分析结果显示，TGF-β1及α-SMA蛋白在高糖刺激后24 h的表达量分别是0 h表达量的13.4及1.8倍(P<0.05)。见表3。

将高糖刺激0 h 及24 h时HKC内THEM4与TGF-β1、α-SMA蛋白表达量进行相关性分析，结果显示THEM4与后两者蛋白均呈负相关关系(相关公式及相关系数分别为y=-5.100 9x+1.178,R2=0.971 1;y=-3.803 3x+1.408,R2=0.893 9)，表明随着THEM4蛋白表达的降低，TGF-β1、α-SMA表达显著增加。

组别TGF-β1α-SMA0h0.064±0.0110.614±0.0356h0.096±0.0150.951±0.020*12h0.429±0.085*#1.279±0.027*#24h0.856±0.054*#△1.085±0.150*#△48h0.243±0.021*#△☆0.382±0.008*#△☆F287.748748.353P0.0000.000

*P<0.05与0 h比较 #P<0.05与6 h比较 △P<0.05与12 h比较 ☆P<0.05与24 h比较(SNK-q检验)

2.4高糖诱导下HKC内ColⅠ、Col Ⅲ分泌 高糖刺激后24 h HKC内ColⅠ、Col Ⅲ分泌较0 h显著增加，差异有统计学意义(P<0.05) ，见表4。

组别ColⅠColⅢ0h11.615±0.5799.437±1.33124h14.831±2.72015.639±3.281t10.60219.233P0.0010.000

3 讨 论

DN是糖尿病最严重的并发症之一，最终导致终末期肾衰竭[9-10]。涉及病因及发病机制非常复杂，包括血流动力学改变、糖代谢紊乱、脂质代谢异常、炎症、生长因子、自噬[11]等多种因素。研究表明Akt的异常激活及TGF-β1的过表达参与了高糖诱导的肾小管上皮细胞向间质细胞转分化过程，从而引起肾脏ECM过度沉积，启动DN肾间质纤维化[12]。在高糖环境中，Ⅰ、Ⅲ、Ⅵ、Ⅳ型各种胶原以及蛋白多糖、纤维黏连蛋白、层黏连蛋白等基质蛋白合成及降解失衡是引起ECM沉积的根本原因。本研究也证实，高糖可诱导HKC内phospho-Akt(Ser 473)、 TGF-β1及α-SMA表达增强，并伴随ColⅠ、ColⅢ的分泌。提示出现ECM沉积。而关于高糖如何激活Akt信号通路的机制研究目前尚未完全明确，探讨其机制并寻求潜在干预靶点将为DN的防治起到关键作用。

有学者发现银杏叶提取物通过抑制Akt信号通路能够缓解DN肾间质纤维化[13]。Shemesh等[14]也发现AS101通过对Akt下游通路的药理学抑制效应，能够减轻DN的进展。THEM4作为Akt内源性负向调控因子，有学者发现维生素D能够直接上调THEM4蛋白的表达，进而抑制Akt/NF-κB通路的活化及COX-2介导的炎症反应[2]。在小鼠肝癌模型[3]中THEM4蛋白表达降低，而通过慢病毒转染使THEM4过表达能有效抑制肿瘤的生长增殖。Knobbe等[15]研究发现在恶性胶质瘤中存在Akt信号通路异常，而THEM4表达降低会解除对Akt的抑制效应，从而促进恶性胶质瘤的发生；同时发现与正常对照组相比，恶性胶质瘤组织中的THEM4 mRNA的表达至少下调了50%，并与THEM4启动子的甲基化相关。因此，THEM4转录水平的下调是恶性胶质瘤发生的机制之一。

本研究同样发现在高糖培养HKC内THEM4 mRNA及蛋白均呈低表达。笔者推测这可能是导致Akt过度活化并上调TGF-β1、α-SMA的表达，最终引起ColⅠ、ColⅢ分泌增加的原因。因此，推测THEM4表达降低可能是导致DN的ECM沉积的潜在因素，故THEM4有望成为防治DN新的干预靶点。

本研究下一步拟采用质粒转染技术将THEM4的表达质粒转染至HKC，进一步探讨THEM4在DN的ECM沉积中的确切机制，以及过表达THEM4能否逆转Akt的激活，进而下调TGF-β1和α-SMA蛋白的表达，减轻ECM沉积，为DN的防治提供新的思路。

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EffectofTHEM4expressiononcollagensecretioninhumanembryokidneyepithelialcellstreatedwithhighglucose

CHEN Ning1, YANG Yong-hui1, AN Xiao-ying1, ZHU Gui-yun1, KANG Li-fei1, HAO Jun2*

(1.DepartmentofPathology,HebeiChestHospital,Shijiazhuang050041,China; 2.DepartmentofPathology,BasicmedicalCollege,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China)

ObjectiveTo investigate the expression of thioesterase superfamily member 4(THEM4) and the relationship between THEM4 and collagen secretion in human embryo kidney epithelial cells(HKC) treated with high glucose.MethodsIn vitro cultured HKC were respectively treated with high glucose(30 mmol/L) for 0, 6, 12, 24 and 48 h. Then cells were collected for the extractions of RNA and total protein. Subsequently, THEM4 mRNA was detected by the method of Real-time PCR. The THEM4, phospho-Akt(Ser 473), transforming growth factor β1(TGF-β1) and α-smooth muscle actin(α-SMA) protein expressions were examined by Western blot. As well, immunofluorescence staining was used to explore the expressions and locations of THEM4. Again, collagenⅠ(ColⅠ) and collagen Ⅲ(Col Ⅲ) were detected using the competitive sandwich ELISA kit.Results①High glucose inhibited THEM4 expression, and induced increased phospho-Akt(Ser 473), TGF-β1, α-SMA in HKC. Again, THEM4 was negatively correlated with TGF-β1 and α-SMA expression(correlation formula: y=-5.100 9x+1.178,R2=0.971 1; y=-3.803 3x+1.408,R2=0.893 9 respectively); ② High glucose induced secreted ColⅠand secreted Col Ⅲ in HKC.ConclusionHigh glucose caused increased ColⅠand Col Ⅲ secretions likely by inhibiting THEM4, up-regulating phospho-Akt(Ser 473), TGF-β1 and α-SMA expressions in HKC.

kidney tubules； epithelial cells； collagen secretion; thioesterase superfamily member 4

2017-08-30；

2017-09-21

河北省医学科学研究重点课题(20150604)

陈宁(1983-)，女，河北石家庄人，河北省胸科医院主治医师，医学博士，从事病理学诊断研究。

*通讯作者

R587.2

A

1007-3205(2017)12-1434-05

刘斯静)