酶法制备莜麦多肽

高鸿蒙

摘要：本研究采用碱性蛋白酶水解莜麦蛋白，制备分子量在5000D以下的莜麦多肽。通过正交实验得出碱性蛋白酶在温度55℃，pH9，酶用量5‰，底物浓度为3%的条件下，酶解2h，其水解度（DH）可達71.96%。

关键词：莜麦；酶解；多肽

1.实验方法

将莜麦种子用粉碎机粉碎，过筛，60℃电热恒温鼓风干燥箱干燥2-4h。取干燥过的莜麦细粉50g，加100ml正己烷于50℃水浴锅中抽提6-8h，离心，沉淀，60℃干燥，得脱脂莜麦粉。取50g脱脂莜麦粉，加100ml的70%乙醇密闭抽提1h，离心，沉淀经60℃干燥脱乙醇得莜麦粗蛋白。用凯氏定氮法测定莜麦粗蛋白粉中蛋白的含量。

将准备酶解的样品100℃煮沸10min。用碱性蛋白酶水解莜麦蛋白制备莜麦多肽。酶解反应到预定时间时，立即放入100℃沸水中灭活10min。灭酶后取1ml酶解液测定酶解反应的水解度。用柠檬酸调节酶解液的pH值到 4.3-4.5，冷藏室静置20min，8000rpm离心15分钟，去除非水解蛋白，得到的上清液即为莜麦多肽液。

用SDS-PAGE法，检测分子量5000D以下的多肽，以胰岛素为分子量参照物（5700D）。

用中空纤维超滤柱分离分子量小于5000D的多肽，将多肽液在旋转蒸发仪（70℃—80℃，0.07Mpa）中浓缩，在60℃烘箱烘干得到莜麦多肽粉。

1.1 测定指标和方法

1.1.1莜麦中脂肪含量的测定：脱脂粉常压烘干法。取一定量的莜麦粉用正己烷脱脂，将脱脂粉干燥，计算差值，可算出脂肪含量。

1.1.2莜麦蛋白含量测定：凯氏定氮法和双缩脲法。

1.1.3水解度的测定：

1.1.3.1标准曲线绘制：取12 支试管分成两组，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml的标准牛血清溶液，用水补足到1ml，然后各加入4ml双缩脲试剂，充分摇匀后，在室温放置30min，于540nm处进行比色测定。取两组测定的平均值，以牛血清白蛋白的含量为横坐标，光吸收度为纵坐标绘制标准曲线，作为定量的依据。（见图1）

1.1.3.2水解度的测定：取2ml加热灭活的酶解液，加入等体积10%的三氯乙酸（TCA），振荡5min，4000rpm/min离心15min，取1ml上清液，加入4ml双缩脲试剂，静置30min，在540nm测定光吸收值，与标准曲线对照得蛋白含量。以计算公式可得水解度（DH）。

计算公式：DH%=（N2-N1）/（N0-N1）×100%

其中：

N0——凯氏定氮所测莜麦粗蛋白粉中的蛋白含量（mg）

N1——反应前蛋白液中10%TCA可溶性蛋白（mg）

N2——反应后酶解液中10%TCA可溶性蛋白（mg）

2.实验结果

2.1 脂肪含量测定结果

脂肪平均含量为3.8%。

2.2 蛋白含量测定结果

未脱脂细粉中蛋白平均含量为11.2%，脱脂细粉中蛋白平均含量为15.68%。

2.3 单因素的确定

2.3.1 温度的确定：酶反应条件为：pH11，底物浓度3%，酶用量5‰，酶解时间2h，试验不同温度对蛋白质水解度的影响。实验表明，当温度在45℃时，DH较大。

2.3.2 pH的确定：酶反应条件为：温度45℃，底物浓度3%，酶用量5‰，酶解时间2h，试验不同pH对蛋白质水解度的影响。实验表明，当pH在10时，DH较大。

2.3.3酶用量的确定：酶反应条件为：温度45℃，底物浓度3%，pH11，酶解时间2h，试验不同酶用量对蛋白质水解度的影响。实验表明，随着酶加量的增加，DH提高，当酶加量达到3‰时再增加酶量，DH值增加不明显。

2.3.4底物浓度的确定：反应条件为：温度45℃，pH11，酶用量5‰，酶解时间2h，试验不同底物浓度对蛋白质水解度的影响。实验表明，随着底物量的增加，DH值提高。

2.4 最佳酶解条件的确定

以温度、pH值、酶用量、底物浓度为四因素各取三水平。以水解度为指标，按L9（34）设计正交试验。实验结果显示，酶的反应条件为：温度55℃，pH9，酶用量5‰，底物浓度3%，水解时间2h，水解度达到最大值71.96%，即A3B1C3D2。各因素对水解度的影响依次为：D>B>A>C，其中底物浓度和温度对水解度的影响较大。对实验结果进行级差分析发现，最佳条件为A3B3C3D2。即温度55℃，pH11，酶用量3‰，底物浓度3%。综合分析，取最佳反应条件：A3B1C3D2。即：温度55℃，pH9，酶用量5‰，底物浓度3%。碱性蛋白酶水解莜麦蛋白水解度结果见表1。

2.5 酶解时间的确定

酶反应条件为：温度55℃，pH9，酶用量5‰，底物浓度3%，试验不同水解时间对蛋白质水解度的影响。实验表明，随着时间的延长，DH值不断增加，在水解达到2h以后，DH值增加不明显，开始变缓。

3.结果分析

通过实验说明可用碱性蛋白酶对莜麦蛋白进行有效水解，产生分子量小于5000D的多肽产品。通过正交试验可获得减性蛋白酶水解莜麦蛋白制备莜麦多肽的最佳条件为：温度55℃，pH9，酶用量5‰，底物浓度3%，酶解时间2h。在此条件下水解度为71.96%。endprint